Method Article

A formação de estruturas biomoleculares ordenada pelo auto-montagem de pequenos peptídeos

DOI:

10.3791/50946

⸱

November 21st, 2013

 , 
1Institute of Chemistry and The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este documento descreve a formação de estruturas com base em peptídeos altamente ordenada pelo processo espontâneo de auto-montagem. O método utiliza peptídeos comercialmente disponíveis e equipamento de laboratório comum. Esta técnica pode ser aplicada a uma grande variedade de péptidos e podem conduzir à descoberta de novos conjuntos com base em peptídeos.

Abstract

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Na natureza, complexas estruturas funcionais são formadas por auto-montagem de biomoléculas em condições suaves. Compreender as forças que controlam a auto-montagem e imitando este processo in vitro vai trazer grandes avanços nas áreas de ciência e nanotecnologia de materiais. Entre os blocos de construção biológica disponíveis, os péptidos têm várias vantagens uma vez que apresentam diversidade substancial, a sua síntese em grande escala é simples, e podem ser facilmente modificados com entidades biológicas e químicas 1,2. Várias classes de péptidos concebidos, tais como péptidos cíclicos, péptidos de anfifilo e peptídeo-conjugados de auto-montam em estruturas ordenadas em solução. Dipeptides Homoaromatic, são uma classe de peptídeos auto-organizados curtas que contenham toda a informação molecular necessário para formar estruturas ordenadas, como nanotubos, esferas e fibrilas 3-8. Uma grande variedade destes péptidos estão disponíveis comercialmente. 9 Os protocolos aqui apresentados podem ser adaptadas a outras classes de péptidos ou blocos de construção biológica e pode potencialmente levar à descoberta de novas estruturas à base de péptidos e para um melhor controlo da sua montagem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formas Natureza ordenado e funcional das estruturas pelo processo de auto-montagem biomolecular. Compreender as forças que governam este processo espontâneo pode levar à capacidade de imitar a auto-montagem in vitro e, consequentemente, grandes avanços na área de ciências de materiais 10,11. Peptídeos, especificamente, são uma grande promessa como um bloco de construção biomolecular, pois apresentam grande diversidade estrutural, a facilidade de síntese química, e pode facilmente ser funcionalizadas com entidades biológicas e químicas. O campo de peptídeo auto-montagem foi iniciada por Ghadiri e seus colegas, que demonstraram a auto-montagem de nanotubos de peptídeo por peptídeos cíclicos com a alternância de D-e L-aminoácidos 12. Outras abordagens de sucesso para o projeto de conjuntos de peptídeos incluem peptídeos lineares bolaamphiphile 5, amphiphiles (AP) 6, peptídeos auto-complementares não conjugados iônicos 13, peptídeos surfactantes-like 4,14, e dibloco copolypeptides 15.

Uma abordagem mais recente envolve a auto-montagem de peptídeos aromáticos curtas, denominado dipeptides homoaromatic. Estes péptidos compreendem apenas dois aminoácidos com carácter aromático (por exemplo, Fen-Fen, terc-butilo (Boc)-Phe-Phe) 7,8,16-21. As estruturas formadas por estes péptidos homoaromatic incluem estruturas tubulares, esferas, os conjuntos do tipo folha e fibras 6,8,15,21-32. As fibras em alguns casos, gerar uma malha de fibrila que produz um hidrogel 33-37. Estes conjuntos foram explorados para aplicações de biosensing, distribuição de medicamentos, a eletrônica molecular, etc 38-45.

Este artigo descreve os passos experimentais necessários para iniciar o auto-montagem espontânea de peptídeos homoaromatic. Além disso, apresenta-se o processo de péptido coassembly. Este processo envolve a auto-montagem de mais do que um tipo de péptidomonómero.

A nossa demonstração inclui o coassembly de dois péptidos disponíveis comercialmente: o péptido difenilalanina (NH2-Phe-Phe-COOH) e o seu análogo Boc protegido (Boc-Fen-Fen-OH). Cada um dos péptidos auto-monta para uma estrutura supermolecular: as formas peptídicas difenilalanina conjuntos tubulares e os péptidos auto-montagem de Boc-Phe-Phe-OH em ​​ambos esferas ou fibras de acordo com o solvente 7,17,46. Nós misturado os dois peptídeos em certas proporções e caracterizadas as assembleias resultaram por microscopia eletrônica, microscopia de força e espectroscopia FT-IR. Os métodos demonstrou a formação de uma estrutura à base de péptido, que é constituída por elementos esféricos com um diâmetro de vários microns (1-4 mm), que são ligados por conjuntos alongados com um diâmetro de algumas centenas de nanómetros (~ 300-800 nm) . Os conjuntos de cadeias assemelham frisado na sua morfologia, como as estruturas esféricas parecem ser enfiada sobre oassembléias alongados. Nós, portanto, classificou essas assembléias "colares biomolecular". Os "colares biomoleculares" poderá servir como um novo biomaterial, como um agente de entrega de drogas ou como suporte para aplicações eletrônicas. Além disso, o processo que conduz à auto-montagem de péptidos podem ser utilizadas com outras classes de péptidos e biomoléculas. Isso pode levar a uma melhor compreensão das forças envolvidas na auto-montagem e a formação de novas estruturas ordenadas.

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Protocol

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1. Auto-montagem de Homoaromatic Dipeptídeos

  1. Pesa-se o péptido desejado na sua forma liofilizada (por exemplo, NH2-Phe-Phe-OH, Boc-Fen-Fen-COOH) e preparar uma solução de reserva dissolvendo o péptido em 1,1,1,3,3,3-hexafluoro -2-propanol (HFP) à concentração adequada (por exemplo, 100 mg / ml para o NH2-Phe-Phe-OH e Boc-Fen-Fen-COOH) 7,17,46.
  2. Misture a solução com vórtice e colocados sobre o banco até que o péptido seja dissolvido completamente e a solução parece claro (alguns minutos).
  3. Dilui-se a solução-mãe de péptido, com um solvente adequado, a uma concentração adequada (por exemplo, 2 mg / ml de NH2-Phe-Phe-OH em ​​água destilada triplo (TDW) para a formação de nanotubos; por adição de 2 ul de péptido solução de estoque de 98 ul TDW, 5 mg / ml de Boc-Fen-Fen-COOH em etanol para a formação de estruturas esféricas).
  4. Manter a solução à TA durante 24hr.
  5. A fim de evitar qualquer preaggregation, preparar soluções de fresco para cada experiência.

2. Coassembly of Two Homoaromatic Dipeptídeos

  1. Prepara-se uma solução de etanol a 50% por mistura de volumes iguais de TDW e etanol absoluto. Use vortex para misturar as duas soluções.
  2. Pesar 2 mg do péptido NH2-Phe-Phe-OH e 1 mg do péptido de Boc-Phe-Phe-OH. Dissolve-se cada péptido em HFP para uma concentração de 100 mg / ml.
  3. Misturar as soluções de peptídeos usando vórtice e colocá-los no banco até os péptidos estão completamente dissolvidos e as soluções parecem claras.
  4. Misturar as soluções de péptidos para a relação desejada. Nesta experiência específica mistura de 10 ul de péptido NH2-Phe-Phe-OH com 6 ul de péptido Boc-Phe-Phe-OH (para uma razão final de 05:03, respectivamente). Devido a elevada volatilidade do solvente HFP, recomenda-se para preparar uma grande quantidade desta solução (em leaSão 10 mL).
  5. Use vórtice para misturar a solução estoque péptidos misturados.
  6. Dilui-se a solução estoque péptidos misturadas com etanol a 50% para a concentração final desejada. Nesta experiência específica, a fim de obter uma concentração final de 5 mg / ml para o NH2-Phe-Phe-OH e 3 mg / ml em vez do Boc-Phe-Phe-OH, respectivamente, adicionar 8 mL da solução de estoque péptidos misturados de 92 ul da solução de etanol a 50%. Use uma pipeta para misturar suavemente a solução.
  7. Manter a solução à TA durante 24 horas.
  8. Deve notar-se que, devido à natureza altamente volátil do solvente, as experiências são sensíveis a pequenas mudanças na concentração dos péptidos. Portanto, as soluções de reserva frescas devem estar preparados para cada experimento.

3. Caracterização das auto montado estruturas utilizando Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

  1. Após 24 horas de incubação, aplicar uma gota de 10 ul da solução de péptidos em enseada vidror deslizamento e seco à temperatura ambiente.
  2. Revestir a amostra sobre o vidro com uma camada fina de ouro (alguns nanómetros) utilizando um revestidor por crepitação durante 90 seg.
  3. Imagem assembléias usando SEM operando a 10-20 kV.

4. Caracterização das auto montado estruturas utilizando Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

  1. Coloque uma gota de 10 ul da solução de péptidos numa grelha de cobre de malha 200 coberta com carvão e estabilizada por um suporte de película de polímero.
  2. Após 1 min remover o excesso de líquido usando papel de filtro.
  3. Prepara-se uma solução de 2% de acetato de uranilo em TDW. Filtrar a solução através da unidade de filtro de 0,22 um.
  4. Para corar a amostra (coloração negativa), colocar uma gota de 10 ul de solução de acetato de uranilo na grelha.
  5. Depois de 30 seg remover o excesso de fluido utilizando papel de filtro. Deve notar-se que, apesar de coloração negativa melhora o contraste das imagens, ele não é essencial em todos os casos.
  6. Imagem da amostra no the grade por TEM operando a 120 kV.

5. Caracterização tridimensional das Assembléias por Microscopia de Força Atômica (AFM)

  1. Prepara-se uma amostra para a análise de AFM utilizando o procedimento descrito no ponto 3.1.
  2. Analisar a amostra sobre o vidro usando um instrumento AFM trabalhar no modo AC. Use vigas de silício com uma constante de mola de 3 N / m e uma freqüência de ressonância de 75 kHz.
  3. Comece a digitalização de uma grande área da grelha, a fim de encontrar a estrutura desejada. Em seguida, se concentrar em uma área menor específico e digitalizá-lo (o tamanho da digitalização foi de 2,5 mM x 2,5 mm para a imagem incluída no manuscrito).

6. Caracterização da Estrutura Secundária de FT-IR

  1. Aplicar uma gota de 30 ul da solução de péptidos para uma janela de CaF 2.
  2. Permitir que a solução a secar à temperatura ambiente.
  3. A adsorção de água no espectro de IR é a 1,650 cm1.Este pico é, no centro da banda de amida I da ligação peptídica. É também um pico característico para as estruturas helicoidais-α de péptidos e proteínas 47. A fim de ultrapassar este problema e evitar o sinal da água, uma troca de hidrogénio para deutério, deve ser realizada. Colocar uma gota de óxido de deutério (D 2 O), sobre a amostra de peptídeo seca. A queda deve ser grande o suficiente para cobrir completamente o depósito de peptídeo na janela.
  4. Deixar a amostra seca sob vácuo.
  5. Repita os passos 6.3 e 6.4 2x para assegurar a troca de hidrogênio-to-deutério máxima. Salve a amostra sob vácuo até a sua análise.
  6. Grave os espectros FT-IR utilizando um sulfato triglycine deuterado (DTGS) detector. O sistema de FT-IV inclui um gerador de gás de purga, a fim de evitar a humidade no ambiente da amostra. Para amostras de peptídeos curtos, é melhor para fazer a varredura da amostra de 2.000 x com uma resolução de 4 cm -1. Os valores mínimos de transmitância pode ser determinada pelo modoftware fornecido com o instrumento.

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Results

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Este documento descreve um método para a formação de estruturas ordenadas na escala nano e micrómetro pelo auto-montagem de peptídeos. De modo a demonstrar este processo simples que apresentar e caracterizar o coassembly de dois péptidos aromáticos simples (Figura 1). Um dos péptidos é o NH2-Phe-Phe-OH (difenilalanina) péptido, que pode auto-montar em uma solução aquosa em estruturas tubulares ocas com dimensões nanométricas 7. O outro péptido é o seu análogo Boc protegido, Boc-Phe...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Em resumo, este estudo demonstra a facilidade com que os conjuntos com base em peptídeos podem ser formados in vitro. O processo envolve a péptidos e solventes comercialmente disponíveis, e isto ocorre espontaneamente sob as condições ambientes, mediante a adição de um solvente polar para o tubo de ensaio. É fundamental utilizar HFP como um solvente dos peptídeos, devido à baixa solubilidade dos péptidos em outros solventes orgânicos. Além disso, devido à alta volatilidade da HFP, é necessário preparar solução ...

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Disclosures

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

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Este trabalho foi apoiado pela Marie Curie Internacional Reintegração Grant e pela Fundação Alemã-Israel. Reconhecemos Mr. Yair Razvag para análise AFM.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NH2-Phe-Phe-OHBachemG-2925.0001
Boc-Phe-Phe-OHBachemA-3205.0005
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanolSigma-Aldrich52512-100ML
Etanol absoluto (desidratado) AR estérilBio-Lab Ltd.52555Mistura com TDW para a preparação de solução a 50% Acetato de
uranilaSigma-Aldrich73943Para coloração negativa. É possível trabalhar sem ele.
lamínula de vidroMarienfeld Laboratory Glassware110590
TEM gridsMicroscopia Eletrônica CiênciasFCF200--50Formvar/Carbono 200 Mesh,
Papel de filtro quantitativoWhatman1001055
Óxido de deutério (D2O)Sigma-Aldrich151882-100G99,9 átomo % D
CaF2 janelaPIKE Technologies160-1212Janela de 25 mm x 2 mm. Para as pontas
provaAspire dos instrumentosCFMRde filtro da série CFMR-25
, 0,22 μ m, PVDF, 33 mm, esterilizado por gama
SEMFEIQuanta 200 ESEM
TEMFEITecnai T12 G2 Spirit
AFMJPK InstrumentsA JPK NanoWizard3
FT-IRThermo Fisher ScientificNicolet 6700 Advanced Gold Spectrometer
FT-IR PurgeParkerBALSTON FT-IR Gerador de Gás de Purga modelo 75-52
Software OMNIC (Nicolet)Thermo Nicolet CorporationPara análise de espectros FT-IR
Misturador de vórticeWisd EquipamentoViseMix VM
PesoMettler ToledoNewClassic MS
Revestidor de pulverização catódicaPolaronSC7640 Revestidor de pulverização catódica
de CFMR Aspire dos instrumentos das measurments de FT-IR, SLGV033RS Millex-GV das unidades de laboratório

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