A Cultura de Tecidos modelo tridimensional para estudar primária da medula óssea humana e suas Malignancies

Summary

Nos métodos padrão de cultura de células são retiradas do seu ambiente fisiológico e cultivadas na superfície de plástico de um prato. Para estudar o comportamento de células de medula óssea humana primária foi criado um sistema de cultura de 3-D, onde as células são cultivadas sob condições sintetizando o microambiente nativa do tecido.

Abstract

A cultura de tecidos tem sido uma ferramenta valiosa para estudar vários aspectos da função celular, a partir de desenvolvimento normal para a doença. Os métodos de cultura de células convencionais contam com a capacidade das células, quer para fixar a um substrato sólido de um prato de cultura de tecido ou de crescer em suspensão num meio líquido. Várias linhas de células imortais foram criados e cresceram utilizando tais abordagens, no entanto, esses métodos falham freqüentemente quando pilhas precisam ser cultivadas ex vivo. Tal falha é atribuída à ausência de componentes de matriz extracelular apropriados do microambiente do tecido a partir de sistemas de cultura de tecido padrão em plástico é utilizado como uma superfície para o crescimento celular. A matriz extracelular é um componente integral do microambiente do tecido e a sua presença é essencial para a manutenção de funções fisiológicas, tais como a polarização celular, sobrevivência e proliferação. Aqui apresentamos um método de cultura de tecido 3-dimensional, onde cel medula óssea primárials são cultivadas em matriz extracelular formulado para recapitular o microambiente do osso humano (sistema RBM). Incorporado na matriz extracelular, as células são fornecidos com os nutrientes através do meio suplementado com plasma humano, proporcionando, assim, um sistema global em que a sobrevivência e proliferação das células podem ser mantidas durante 30 dias, mantendo a composição celular do tecido primário. Usando o sistema RBM que cresceram com sucesso de células de medula óssea primárias de dadores normais e de pacientes com amiloidose, e várias doenças malignas hematológicas. O sistema RBM permite a visualização directa, na matriz em tempo real do comportamento celular e da avaliação da eficácia pré-clínico de novas terapias. Além disso, as células podem ser isoladas a partir da RBM e subsequentemente utilizada para a transplantação in vivo, separação de células, citometria de fluxo, e de ácidos nucleicos e a análise de proteínas. Tomados em conjunto, o método RBM fornece um sistema confiável para o crescimento de marro ósseo primáriow células sob condições fisiológicas.

Introduction

A cultura de tecidos foi desenvolvido para estudar o comportamento de células num ambiente controlado, para minimizar a variabilidade sistémica quando se comparam diversos processos em organismos intactos. Este método foi estabelecido pela primeira vez no início de 1900 e ^1,2 se refere a uma técnica onde explantes de tecido foram cultivadas ex vivo em um prato de vidro. Em meados de 1900 o sistema foi adaptado para cultivar células dispersas em vez de fragmentos de tecidos intactos, e 'cultura de tecidos »e de" cultura de células "tornou-se sinônimo ^3. Nestes sistemas de cultura celular convencionais células são cultivadas na superf....

Protocol

1. Preparação Prévia

1. Mantenha pipetas sorológicas estéreis e pontas de pipeta a 4 ° C.
   Solução de problemas: géis Matrigel à temperatura ambiente (RT); usando pipetas frios e dicas impedirá Matrigel de gelificação durante a configuração da cultura.
2. Descongelar uma garrafa de Matrigel a 4 ° C durante a noite.

2. Preparação dos Reagentes

1. Preparação da solução de fibronectina: Preparar uma solução de 1 mg / ml de caldo de fibronectina por dissolução de 100 mg de fibronectina humana em 100 ml de água destilada. Uma vez que a fibronectina se dissolva, o filtro esterilizado, alíquota....

Results

Uma vez que as células de medula óssea primária não proliferam em condições de cultura de tecidos padrão, o sistema RBM foi criado para imitar de perto o microambiente do osso, proporcionando um sistema de cultura e expandir células BM ex vivo. Os principais componentes da matriz extracelular BM, fibronectina, colagénio I, colagénio IV e laminina ^21, foram incorporados em matriz RBM para fornecer o andaime estrutural para esta cultura em 3-D. Endósteo, o interface entre o osso e a BM, rico em colagén.......

Discussion

O modelo RBM fornece um sistema completo onde a composição celular da BM é mantida ex vivo por até 30 dias. BM células cultivadas em RBM auto-estratificar de acordo com a sua função mimetizando a arquitetura BM encontrado in vivo. Além disso, este é o primeiro sistema que permite a expansão do clone de mieloma múltiplo ^{de 8.} Os passos mais críticos para assegurar o crescimento robusto de células de MO e o sucesso global da cultura são: 1) para obter uma população saudável das células de MO c.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de proliferação CellTrace CFSE para citometria de fluxo	Invitrogen/Life Technologies	C34554
Fibronectina de plasma humano	Millipore	NG1884448
Ficoll-Paque PLUS	GE Lifesciences	17-1440-02
Matriz de membrana basal Matrigel	BD Biosciences	354234
Colágeno de cauda de rato tipo I	BD Biosciences	354249	Collagen I da Millipore não polimeriza adequadamente usando este protocolo
Meio de montagem VECTASHIELD para fluorescência (conjunto regular)	Vector Laboratories	H-1000
SigmaFast Red TR / Napthol AS-MX comprimidos	Sigma-Aldrich	F4648	Para coloração TRAP
SigmaFast BCIP / NBT comprimidos	Sigma-Aldrich	B5655	Para coloração de fosfatase alcalina
Microscópio confocal LSM 510 Zeiss	Software Carl Zeiss
Zeiss 510	Software de análise de imagem	Carl Zeiss
Microscópio invertido Zeiss Axiovert 200M	Software Carl Zeiss
MetaMorph	Molecular Devices		Software de análise de imagem para Axiovert 200M
FACSort citômetro de fluxo	Software BD Biosciences
CellQuest Pro	Software BD Biosciences		para análise de dados de citometria de fluxo