Artigo de método

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

19.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/50951

⸱

19 de setembro de 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Neurology, Hertie Institute for Clinical Brain Research, 2Institute of Pharmacology, University of Bern, 3Department of Immunology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Clinic Tuebingen, 5Department of Neurology, University Hospital Erlangen

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha um método para isolar células apresentadoras de antigénio a partir de timo humano por meio de diferentes passos de digestão enzimática do tecido seguida por centrifugação de densidade da suspensão de células individuais e finalmente separação magnética e / ou FACS das populações de células de interesse.

Resumo

Neste protocolo, proporcionar um método para isolar as células dendríticas (DC) e células epiteliais (TEC) a partir do timo humano. DC e TEC são a principal célula apresentadoras de antígenos (APC) tipos encontrados em um timo normal e está bem estabelecido que desempenham papéis distintos durante a seleção do timo. Essas células estão localizadas em microambientes distintos no timo e cada tipo APC representa apenas uma pequena população de células. Para melhor compreender a biologia destes tipos de células, a caracterização dessas populações de células é altamente desejável, mas devido à sua baixa frequência, o isolamento de qualquer um destes tipos celulares requer um procedimento eficiente e reprodutível. Este protocolo detalha um método para obter células adequadas para a caracterização de diversas propriedades celulares. Tecido do timo é mecanicamente perturbado e após diferentes passos de digestão enzimática, a suspensão de células resultante é enriquecida com um passo de centrifugação de densidade de Percoll. Para o isolamento de mielóide DC (CD11c <sup> +), células da fração de baixa densidade (FDL) são immunoselected por separação de células magnéticas. O enriquecimento de populações TEC (Mtec, CTEC) é alcançada por esgotamento de hematopoiéticas (CD45 hi), as células da fração de baixa densidade celular Percoll permitindo a sua posterior isolamento através de fluorescência de células ativadas (FACS) utilizando marcadores específicos de células. As células isoladas podem ser usadas para diferentes aplicações a jusante.

Introdução

O timo é o órgão em que o desenvolvimento de células T ocorre. O seu tamanho relativo e absoluto diminui com a idade, quando se torna sucessivamente substituído por gordura, embora a actividade do timo pode ainda ser detectado na velhice. A sua importância para a resposta imune foi demonstrado na década de 1960 1.

O repertório de células T é formada através da interacção dos receptores de células T com complexos de peptídeo-MHC em diferentes tipos de APC do timo, que fornecem sinais de sobrevivência ou morte para o desenvolvimento de células T, resultando em um repertório de células T funcionais e são amplamente auto-tolerante 2.

Aproximadamente 98% das células do timo humano estão a desenvolver células T referidos como timócitos. Os restantes 2% são constituídos por um número de diferentes tipos de células, incluindo uma variedade de TCE (cortical, medular, subcapsular), mielóide e plasmocitï DC (MDC, pDC), macrófagos, células B, células T re-circulação maduras, granulócitos, fibroblasts, células endoteliais e células epiteliais muito raras com um fenótipo de expressão semelhante ao de células de outros tecidos tais como o músculo, os neurónios e epitélio respiratório (Figura 1). Destes, TEC e DC são os principais tipos de APC encontrados em um timo normal. Nos últimos anos, a purificação destes tipos da APC para a cultura e perfil molecular ganhou mais e mais interesse. Devido à sua baixa frequência, o isolamento de qualquer um destes tipos de células para análise detalhada requer um processo eficiente, reprodutível e de baixo custo. O método aqui apresentado é uma modificação a partir de estudos publicados anteriormente 3,4.

Tal como acontece com qualquer outro tecido, extracção a partir de células do timo pode ser conseguida por via enzimática a desagregar-célula e redes de interacção célula-matriz, a fim de obter uma suspensão de células individuais. Existem certos parâmetros, como uma boa eficiência de dissociação, o rendimento celular, viabilidade celular e retenção de célula smarcadores urface que são cruciais e devem ser otimizados para o isolamento de sucesso destas populações de células raras.

Neste protocolo, o isolamento de DC e subconjuntos TEC é realizada através de uma suspensão de uma única célula do tecido por perturbação mecânica e de digestão enzimática. Usamos colagenase A de Clostridium histolyticum, que tem uma proporção equilibrada de diferentes actividades enzimáticas, para quebrar o colagénio nativo que mantém o tecido em conjunto. ADNase I está incluído na solução de enzima para reduzir a agregação das células, devido a ADN isento de células mortas (timócitos são muito sensíveis). Também proporcionam uma abordagem alternativa para a digestão enzimática do tecido típica envolve o tratamento de tecidos mecânica e enzimática assistida por um Dissociator tecido. A suspensão de célula única é então sujeito a uma única centrifugação de densidade de Percoll para o enriquecimento da fracção de baixa densidade (LDF) de células. A partir desta fracção de células, DC pode ser isolado através de coloração fou DC marcadores de superfície (isto é, CD11c +) e utilizando separação magnética ou de células activadas por fluorescência (FACS). Ao contrário das células linfóides que compreendem a maioria das células no timo, o TEC não expressam CD45 em níveis elevados, mas são positivas para a adesão da célula epitelial molécula EpCAM. CTECs pode ser distinguido do TCE medular pela expressão de um antigénio ainda indefinido reconhecido pelo CDR-2 (dendrítica reticulócitos-2 cortical) de anticorpo de 4,5 e um pouco menor expressão EpCAM. O diferencial de co-expressão de EpCAM e CDR2 permite o isolamento eficaz desses subconjuntos TEC através de células de elevada velocidade de triagem 6.

O protocolo aqui apresentado é otimizado para o tecido do timo humano. A duração do processo depende da quantidade de tecido e a capacidade do experimentador, bem como a velocidade do classificador de células, se for utilizado separação FACS. Normalmente, o protocolo para o isolamento de DC pode ser concluída dentro de 5Hr -6 e para o isolamento do TCE em 8-10 horas. O isolamento de DC e subconjuntos do TEC a partir de tecido do timo é sensível ao tempo. Quanto mais rápido o processo de isolamento, a melhor o estado das células. Finalmente, as células isoladas podem ser utilizadas para outras investigações, como estudos comparativos de ARNm e a expressão da proteína, as experiências de PCR, o isolamento da proteína, o perfil molecular (isto é, transcritômica, análise de micro RNA), assim como a cultura de 6 células.

Declaração de Ética

A fim de ser capaz de trabalhar com o tecido do timo humano o pesquisador precisa obter a aprovação do comitê de ética local ou autoridades responsáveis, bem como um consentimento informado por escrito do doador (ou geralmente seus pais, uma vez que o tecido é geralmente obtida a partir de menor de idade crianças). Além disso, todos os tecidos humanos devem ser tratadas como sendo devem ser tomadas medidas potencialmente infecciosas e apropriados, tais como trabalhar com luvas, etc.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Preparação de ferramentas, soluções enzimáticas e amortecedores

Execute as seguintes etapas de preparação antes do início do protocolo.

  1. Ferramentas
    Limpo, seco e autoclave as seguintes ferramentas e mantê-los em embalagem estéril até o uso.
    1. Pequenas tesoura afiada com pontas ou curvas ou retas para cortar o tecido do timo. Pequenas pinças curvas com pontas serrilhadas para lidar com o tecido.
    2. 50 ml de Oak Ridge centrífuga Tubos, PC, para a etapa de centrifugação Percoll densidade.
  2. Soluções enzimáticas
    Prepare a colagenase / ADNase I enzima misturar (2 mg de colagenase / mL e 0,1 mg de ADNase I / ml) como segue:
    1. Dissolve-se 500 mg de liofilizado de colagenase A (Roche) em 250 ml de meio RPMI 1640 plano (sem FCS) para obter uma solução a 2 mg / ml de colagenase. Colagenase é bastante difícil de dissolver, por isso recomenda-se a deixá-lo algum tempo em uma montanha-agitador à temperatura ambiente.
    2. Dissolve-se 100 mg de ADNase I (Roche) em10 ml de água destilada estéril. 2,5 ml aliquotas podem ser guardadas a -20 ° C. Adicionar 2,5 ml de solução a 10 mg de ADNase I na solução de 2 mg de colagenase A.
    3. Efectuar a filtração estéril da mistura de colagenase / ADNase utilizando uma unidade de filtro Stericup (0,22 mM). Armazenar em 10-20 mL de alíquotas a -20 ° C até à sua utilização.
  3. Tampões e Soluções
    1. Solução de estoque 1,5 M de NaCl: Dissolver NaCl em água destilada estéril até uma concentração final de 1,5 M. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um e armazenamento à temperatura ambiente.
    2. Tampão 10x MACS: 1 x PBS (Ca 2 + / Mg 2 + livre) contendo 5% de BSA e 20 mM de EDTA. Efectuar a filtração estéril da solução com um filtro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C. Antes de utilizar, preparar uma solução 1x diluindo o estoque de 10x para 1x no frio estéril 1x PBS.
    3. FACS buffer: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 + livre) contendo 1% de BSA e 0,02% de NaN3.
    4. FACS buffer para separação de células: 1x PBS (Ca 2 + / Mg 2 + livre) contendo 2% de BSA. Esterilizar utilizando um filtro de seringa de 0,22 um e armazenar a 4 ° C.

2. Preparação do Tecido

A transformação do tecido deve ser realizada utilizando reagentes estéreis e o trabalho num gabinete de fluxo laminar. Antes do procedimento começa, prepare os seguintes reagentes e equipamentos:

    1. Aquece-se a seguir a RT: meio RPMI 1640 completo (RPMI 1640, 10% soro fetal de bovino, 1% de pen / strep), meio RPMI 1640 normal, Ca 2 + / Mg 2 + livre de PBS e uma solução enzimática de colagenase / ADNase 2x.
    2. Incubadora térmica quente com unidade de rotação de 37 ° C e frio ângulo fixo rotor de centrífuga a 4 ° C.
    3. Prepare uma caixa com gelo.

Nota: a duração deste passo depende da condição e tamanho do tecido. Cerca de 20-30 minutos é o tempo razoável necessário para uma peça de tamanho médio de tissue em bom estado (~ 5 cm de largura).

  1. Coloque o tecido em uma placa de Petri contendo PBS estéril e enxaguar qualquer sangue residual.
    1. Adicionar PBS fresco para evitar que o tecido de secagem e usando uma pinça e tesouras limpar o tecido a partir de coágulos sanguíneos, tecido conjuntivo e gordura e qualquer parte que não parece saudável.
    2. Tome cuidado para remover o tecido necrosado que vai aumentar a quantidade de detritos.
    3. Depois de limpar, pesar tecido para referência.
    4. Corte o tecido em cerca de 1 cm 3 peças / blocos. Adicionar suficiente PBS para cobrir o tecido.

Nota: Para a reprodutibilidade dos resultados, o tecido deve ser cortada em pedaços de tamanho uniforme.

  1. Usando a parte traseira de uma seringa estéril (10-20 ml) aplicar pressão (não muito vigorosa ou prolongada) para os pedaços de tecido tímico. Este procedimento irá remover a maior parte dos timócitos, reduzindo, assim, o volume de tecido para ser digerida depois. Execute esta etapa no gelo e trabalhar rápido.
  2. A solução se tornará visivelmente turva como timócitos são liberados. Agita-se o prato gentilmente e depois com a ajuda de uma pipeta de 5 ml ou um aspirador de vidro remove-se o sobrenadante contendo os timócitos tomando cuidado para não aspirar acidentalmente os pedaços de tecido.

Dica: Um raspador de cultura de células estéril pode ser usada para concentrar todos os pedaços de tecido de um lado do prato depois inclinar o prato (45 ° de ângulo) e aspirar o sobrenadante. Substitua com PBS fresco e repita este procedimento até que o sobrenadante é relativamente transparente. Realize última lavagem com RPMI simples.

  1. Picar pedaços de tecido usando uma tesoura afiada (tão finamente quanto possível, os fragmentos devem ser, pelo menos, 2-4 mm). Os fragmentos devem ser pequenos o suficiente para inserir uma pipeta de 5 ml.

3. Preparação de suspensão única célula de Thymus Tissue

Aqui,duas abordagens alternativas para este passo encontram-se descritos. A primeira abordagem descreve uma digestão enzimática do tecido típico (seção 3.1), enquanto o segundo envolve o tratamento de tecido mecânico e enzimático assistida por um Dissociator tecido (seção 3.2).

Este protocolo é otimizado para o processamento de amostras de tecido pesando 5 g. Para amostras de tecido maiores ou menores, ajustar volumes de enzima em conformidade.

3.1 digestão enzimática típica tecido para se obter uma suspensão de célula única

  1. Colocar o tecido triturada em tubos de 50 ml com 10 ml de solução de colagenase / ADNase por 5 g de tecido. Adicionar RPMI simples para se obter um volume total de 20 ml.

Nota: em um tubo de 50 ml de digerir-se a 10 g de tecido. Ajustar o volume da enzima de acordo.

  1. Incubar a suspensão de tecido, durante 40 min a 37 ° C sob rotação lenta em um incubador térmico.

Nota: as etapas de incubação pode ser realizada em um incubador térmico com uma unidade de rotação, ou num incubador bacteriano a 37 ° C, com um agitador.

  1. A solução enzimática irá tornar-se turva como células são liberados para ele. No final da digestão, o tubo de centrifugação a 110 xg durante 2 min para sedimentar os fragmentos de tecido.
  2. Coletar sobrenadante desta digestão rodada. Centrifugue a suspensão de células durante 10 min a 400 x g. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 10-50 ml de RPMI completo, dependendo do tamanho do agregado de células.
  3. Mantenha suspensão de células em 37 ° C incubadora com a tampa solta.
  4. Se o número de células maiores são desejadas, o passo de digestão pode ser repetido com os restantes fragmentos de tecido e o primeiro e o segundo digerir reunidas. Além disso, se TEC deve ser isolada, duas rodadas de digestões deve ser realizada.
  5. Dilui-se uma alíquota da suspensão de células em azul de tripano (1:10-1:100) e contagem de células viáveis ​​utilizando um hemocitómetro.
  6. Mantenha as células a 37 ° C na incubadora até que esteja pronto para avançar para a centrifugação de densidade Percoll (seção 4). Isolamento subsequente de subconjuntos DC (seção 5) será realizada a partir dessas células.

Nota: os tecidos do timo pode variar na sua composição, em especial com a idade, que afecta a eficiência da digestão e a geração de uma suspensão de célula única.

  1. Para o isolamento posterior de células epiteliais tímicas (TEC) é necessária uma terceira rodada de digestão enzimática. Tecidos remanescentes Ressuspender em 10 ml de solução de colagenase / ADNase fresco mais 10 ml de meio RPMI simples e adicionar tripsina / EDTA (1:50 de 2,5%) de uma solução.
  2. Incubar a 37 ° C durante 40 minutos com rotação suave. Durante a última de 10 - 15 min de incubação a adicionar FCS (1:5) para neutralizar a actividade de tripsina.
  3. Centrifugar a 110 xg durante 2 min à temperatura ambiente para sedimentar os fragmentos de tecido.

Nota: O tecido não pode ser completamente digerido após esses três rodadas de digestões. Idade e estado geral do tecido são dois parâmetros que influenciam a eficiência de dissociação do tecido do timo.

  1. Recolher o sobrenadante celular e descartar os fragmentos de tecido sedimentadas.
  2. Centrifuga-se o sobrenadante das células a 400 xg durante 10 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em meio RPMI completo.

Dica: pelotas celulares são bastante frouxa, por isso tome cuidado quando descartar / aspiração sobrenadante.

  1. Contagem de células viáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Colocar as células em uma incubadora a 37 ° C até a proceder à separação de Percoll (a secção 4). Subsequente pré-enriquecimento de células TEC pela depleção de células CD45 hi será realizada a partir dessas células (Secção 6).

3.2 tratamento tecido mecânico e enzimático assistida por um tecido Dissociator

Usando o tecido Dissociator abordar as etapas de digestão do tecido pode ser reduzido a metade do tempo necessário com a abordagem descrita acima (seção 3.1). O protocolo que se segue é uma versão modificada da que utilizada para dissociar o tecido do timo do rato para o isolamento de TEC 7,8.

  1. Transferência de 5 g de pedaços de tecido de carnes (passo 2.5) em um tubo de C contendo 10 ml de solução de colagenase / ADNase.
  2. Adaptar tubo C para a Dissociator tecido e m_spleen_02 programa run (10 seg.) Repita este programa 4-5x (40-50 seg.)
  3. Incubar, com rotação suave, durante 20 min a 37 ° C.
  4. Centrifugar a 110 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
  5. Recolher o sobrenadante e proceda como na etapa 3.1.4. Adicionar 10 ml de solução de colagenase / DNase fresco.
  6. Adaptar tubo C para a Dissociator tecido e m_spleen_01 programa run (56 seg.)
  7. Incubar a 37 ° C durante 20 minutos com rotação suave.
  8. Centrifugar a 110 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
  9. Collecsobrenadante de células T e o pellet a suspensão de células durante 10 min a 400 x g. Proceder como na etapa 3.1.4.
  10. Conforme descrito no ponto 3.1.9 é necessária uma terceira rodada de digestão para o posterior isolamento de células epiteliais tímicas (TEC). Por isso, os restos de tecido ressuspender em 10 ml de solução de colagenase / ADNase fresco mais tripsina / EDTA (diluição 1:50 de estoque de 2,5%)
  11. Incubar a 37 ° C durante mais 20 minutos com rotação suave. Adicionar FCS (1:5) e incubar por mais 10 min.

Nota: Usando essa abordagem, após esta última etapa da digestão do tecido geralmente é completamente dissociado e sem fragmentos de tecido não digeridos são observados.

  1. Proceder como em passos 3.1.11-3.1.14.

4. Enriquecimento da LDF de células usando Separação Percoll densidade

Após a digestão enzimática de tecido, suspensões de células individuais do timo totais são sujeitas a um único centrifugat Percollpasso de iões para enriquecer as células LDF. O LDF de células é altamente enriquecido para APC. Ambos DC e TCE são detectados nesta fracção de células.

  1. Use suspensão única célula obtido a partir da 1 ª e 2 ª digere para mDC isolamento (células agrupadas, veja o passo 3.1.8) ou 3 º digest (para isolamento TEC) (3.1.14). Suspensão de células individuais obtidas a partir de centrífuga de cada passo de digestão a 400 xg durante 10 min.
  2. Prepara-se uma solução de Percoll com uma densidade final de 1,07 g / ml, durante este passo de lavagem (ver exemplo na tabela abaixo).
    Preparação da solução de Percoll para uma densidade final de 1,07 g / ml (ρ = 1,07)
    Tubo Não. 1 2 3 4
    Não diluído Percoll (ρ = 1,130) (ml) 2.96 5,92 8.88 11.84
    1,5 M de NaCl (ml) 0,6 1.20 1.8 2.4
    H2O destilada (mL) 2.44 4,88 7,32 9.76
    Volume de final de diluição de trabalho 6 ml 12 ml 18 ml 24 ml
  3. O número de tubos de Percoll depende do número de células em determinados passos 3.1.8 e / ou 3.1.14. Combine as soluções estéreis e misture bem. Para o isolamento ideal, 0,6-1 x 10 9 células pode ser carregado por tubo de Percoll. Combine as soluções estéreis e misture bem.

Dica: Percoll é sensível à luz e, além disso, deve ser mantido frio. Prepare a primeira mistura contendo o NaCl e H2O (TA) e adicionar diluído Percoll último, pouco antes de ressuspensão das células na solução de Percoll.

tenda "> Nota: densidade Percoll pode variar entre diferentes fornecedores e lotes Se a densidade da solução de Percoll não diluído não é igual a 1,130 g / ml, utilize as instruções fornecidas pelo fabricante para calcular as quantidades exatas de Percoll e H 2 O necessária para obter uma densidade final de 1,07 g / ml.

  1. Ressuspender até 1 x 10 9 células em 6 ml de solução de Percoll preparada (ρ = 1,07), misturar suficientemente para obter uma suspensão homogénea, e transferir para um tubo de tampa de rosca de policarbonato de centrífuga de 50 ml de Oak Ridge.
  2. Camada cuidadosamente 30 ml de meio RPMI completo por tubo com uma pipeta no topo da suspensão de solução de Percoll / célula. Carregar o meio lentamente, de modo a que permaneça no topo da suspensão e ter o cuidado de não perturbar a camada.
  3. Pesar os tubos para se certificar de que eles têm pesos iguais, de modo que eles estão equilibradas durante a centrifugação. Se eles não estiverem, adicione cuidadosamente mais meio ao tubo mais leve (menos de ruacondições erile).
  4. Transferir cuidadosamente os tubos para uma centrífuga previamente arrefecido com um rotor de ângulo fixo, e centrifugação a 3500 xg durante 35 min, a 4 ° C com o freio. Certifique-se de que a temperatura da centrifugadora em não superior a 4 ° C.
  5. Retire os tubos da centrifugadora e cuidadosamente recolher o APC enriquecido, encontrado na interfase entre o Percoll e meio (fracção de baixa densidade) a partir de cada tubo com uma pipeta Pasteur estéril. Transferência de células em um tubo de 50 ml contendo frio completo RPMI. Encha o tubo, a fim de diluir o restante Percoll.
  6. Centrifugar a suspensão de células durante 10 minutos a 300 xg, a 4 ° C. Elimine o sobrenadante e lavagem de repetição.
  7. Ressuspender o sedimento de células em meio e determinar o número de células (utilizando azul tripano e um hemocitómetro). Na nossa experiência, a percentagem das células FDL é cerca de 2-20% da suspensão de célula única total obtido após a digestão enzimática. A y típicoield de células enriquecidas de baixa densidade (de uma nova gama de timo, anos um dia-2) é 1x10 8 células por 1 x 10 9, o que representa 10% do total de células individuais de células em suspensão.

Nota: Nesta etapa, você pode observar que as células agregadas na suspensão (especialmente com amostras de crianças de idade mais avançada). Aglomerados celulares são indicação de morte celular e resultado da liberação de DNA das células moribundas que podem ficar células juntas. Nesse caso, adicionar DNase I na amostra (50 ug / ml) e incuba-se que para cima de 20 min à temperatura ambiente (inverter cuidadosamente todos os 5 min) para digerir as moléculas de ADN livre.

5. Isolamento do timo mDC

Após APC enriquecimento (por separação de Percoll), mDC pode ser eficientemente isolado do LDF após a primeira e segunda ronda de digestões enzimáticas. O protocolo que se segue é uma versão modificada de separação magnética de células para o isolamento de mDC (CD11c +).

  1. Centrífuga APC enriquecida de células isoladas a partir da suspensão de células individuais obtidas a partir da primeira e segunda digestão enzimática agrupada a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender sedimento de células em tampão 100 ul por MACS 10 7 células.
  2. Adicionar 5 uL de anticorpo CD11c-PE por 10 7 células.

Nota: experimentos de titulação são recomendados para melhores resultados.

  1. Misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C, protegidos da luz.
  2. Lavar as células por adição de 1-2 ml de tampão por MACS 10 7 células e centrifugar a 300 xg durante 10 min.
  3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender completamente até 10 7 células em 80 mL de tampão MACS.
  4. Adicionar 20 ul microesferas anti-PE por 10 7 células.
  5. Misture bem (não vortex) e incubar durante 15 min a 4 ° C, protegida da luz.
  6. Repita como no passo 5.4.
  7. Ressuspender 8 até 10 células em 500 ul de tampão.
  8. Se necessário, a suspensão de célula de filtro usando um filtro celular de 40 mM para remover detritos celulares e agregados, que podem obstruir o fluxo da coluna.
  9. Use uma coluna LS desde suspensões de células do timo fluir melhor através das colunas LS. Prepare coluna LS seguindo as instruções do fabricante. Suspensão de células de pipeta lentamente na coluna evitando gerando bolhas. Use uma coluna para cada 1 x 10 8 células.
  10. Lavar coluna seguindo as instruções do fabricante. Remover coluna de ímã e coloque-o em um estéril 12 ml rodada tubo de polipropileno de fundo. Adicionar 3 ml de tampão MACS na coluna e recolher as células magneticamente marcadas, inserindo e empurrando firmemente o êmbolo para dentro da coluna.
  11. Recolher a fracção eluída representando o CD11c + mDC e centrifugar a 400 xg durante 6 minutos.
  12. Determinar o número de células e confirmar a pureza da populati célula selecionadapela análise por citometria de fluxo. Sugeridas incluem marcadores CD45, CD11c e HLA-DR.

Nota: CD11c + mDC podem também ser isolados utilizando um separador FACS.

6. Enriquecimento de células CD45 lo / neg para classificação celular da TEC

Para o isolamento da TEC, as células podem ser pré-enriquecida pela depleção de células CD45 hi utilizando microesferas de CD45, de modo a acelerar o seu isolamento por meio de separação de células.

Use suspensão de células individuais obtidas a partir da etapa de digestão 3 rd (3.1.14) e posteriormente separadas por centrifugação de Percoll.

  1. Suspensão de células de centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender o sedimento celular em 80 ul de solução tampão por MACS 10 7 células.
  2. Use micropérolas CD45 a 1/3 da quantidade recomendada (6,7 mL) por 10 7 células.

Nota: Ao usar uma quantidade menordas microesferas de nós pré-enriquecer células tanto para CD45 lo e as células CD45 neg. Titulação é recomendado para melhores resultados.

  1. Misture bem sacudindo suavemente o tubo (Não Vortex) e incubar por 15 minutos a 4 ° C.
  2. Lavar as microesferas não ligadas por adição de 10 ml de tampão e centrifuga-se MACS durante 10 minutos a 300 xg, a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante completamente.
  3. Ressuspender 8 até 10 células em 500 ul de tampão.
  4. Se necessário, a suspensão de célula de filtro usando um filtro celular de 70 mM para remover detritos celulares e agregados, que podem obstruir o fluxo da coluna.
  5. Use uma coluna LS desde suspensões de células do timo fluir melhor através das colunas LS. Prepare coluna LS seguindo as instruções do fabricante. Suspensão de células de pipeta lentamente na coluna evitando gerando bolhas. Use uma coluna para cada 10 8 células.
  6. Coletar as células não marcadas (escoamento e lavagens) contendoa fracção de células lo / neg CD45 e lavagem da coluna, seguindo as instruções do fabricante.
  7. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender sedimento celular em tampão FACS estéreis, a fim de determinar o número de células e continuar a coloração para separação de células.

7. Células Stain para classificação celular de fluorescência Activated

  1. Realizar FcR bloqueio antes da coloração das células, a fim de reduzir o anticorpo não-específico de ligação. Incubar a suspensão de células com solução de imunoglobulinas humanas reunidas durante 15 min à temperatura ambiente. Estes reagentes encontram-se comercialmente disponíveis (ou seja, Gammunex 10% de solução).
  2. Lavar as células por adição de tampão de FACS estéril fria. Centrifugar a 400 xg durante 6 minutos a 4 ° C.
  3. Elimine o sobrenadante e ressuspender as células em tampão FACS estéril frio. Prepare 5 amostras de acordo com o seguinte exemplo:
    Amostra Tipo de amostra Anticorpo Número de celular O volume total
    1. imaculado controle 1 x 10 6 50 ul
    2.scc *-Pacific Blue controle CD45-Pacific Blue 1 x 10 6 50 ul
    3. SCC-APC controle CD3-APC 1 x 10 6 50 ul
    4.scc-Alexa 488 controle CD8-Alexa 488 1 x 10 6 50 ul
    5. Separação de células analito CD45-Pacific Blue
    EpCAM-APC
    CDR2-Alexa 488     		10 x 10 6 - 50 x 10 6 500 ul
    10 x 10 6 mL células/100

    * SCC, controle de cor única

  4. Incubar as células com os anticorpos durante 30 min, em gelo no escuro.
  5. Lavar duas vezes com tampão FACS, centrifugando as células a 400 xg durante 6 minutos a 4 ° C.
  6. Ajustar a concentração de células da amostra a ser classificado para um x10 7 células / ml (ou à concentração recomendada pela instalação de triagem de células) utilizando FACS estéreis tampão de separação de células (isto é, sem NaN 3).
  7. Passe amostra de células através de um filtro de células 70 mM para remover quaisquer aglomerados de células que podem entupir o citômetro durante a classificação.
  8. Ressuspender as amostras de controlo em 200-400 ul de tampão. Manter os tubos em gelo e protegida da luz.
  9. Prepare tubos de coleta com o meio.

Notas:

  • Realizar a titulação dos anticorpos para coloração óptima.
  • Em um exemplo, para seleccionar, de até 50 x 10 6 células podem ser coradas em um volume total de reacção de500 ul.
  • Realizar a coloração da amostra a ser classificada em 5 ml Falcon poliestireno tubos de fundo redondo. Os controlos de cor individuais podem ser coradas em poços separados de uma placa de 96 poços.
  • Desde subconjuntos TEC são populações raros, é aconselhável a utilização de outro marcador positivo (de alta frequência) para cada fluorocromo para facilitar a determinação das configurações FACS adequadas e para se certificar de que você tem uma compensação adequada se a escolha de fluorocromos exige compensação. As células a partir da fracção CD45 + podem ser marcadas com marcadores tais como CD45, CD3 ou CD8 para os diferentes fluorocromos e depois da coloração das células não coradas CD45 + podem ser adicionados à amostra.

8. Isolamento do TEC por fluorescência celular ativado

Subconjuntos TEC podem ser classificados a partir da fração lo / neg CD45 como EpCAM oi CDR2 - (Mtec) ou EpCAM lo CDR2 + (CTEC).

  1. Execute o wit amostrah as células não coradas e ajustar a dispersão frontal e lateral, a fim de colocar a população de interesse em escala. Ajustar a tensão em cada um dos detectores de modo a que as células são visíveis, mas localiza-se na parte do lado mais à esquerda do histograma.
  2. Execute cada amostra manchado único e ajustar a compensação para cada cor.
  3. Depois de ajustar a tensão e compensação para os controles manchadas não coradas e individuais executar o exemplo a ser classificada e ferramentas de uso gating para definir a população de interesse. Use uma ampla frente e dispersão lateral portão para garantir a inclusão de todos os tamanhos de células do estroma, excluindo os restos celulares.
  4. No gráfico de pontos com o Blue CD45-Pacífico contra portão Forward Scatter sobre as células neg baixos e CD45 CD45.
  5. Aplicar esta porta para uma EpCAM contra CDR2 gráfico de pontos e determinar por gating as populações a serem ordenados.
  6. Uma vez portões foram determinadas, selecione as portas que contêm as populações de interesse e começar a classificação.
  7. células Uma vez classificados foram recolhidos, de centrifugação da suspensão de células, e células de ressuspender em meio ou tampão de escolha, dependendo da aplicação pretendida a jusante.

Nota: Durante a triagem, a fim de evitar que as células adira às paredes do tubo de recolha, o tubo pode ser pré-revestida, enchendo--se com 50% de FCS em PBS e incubados à TA durante 30 min. Descartar a solução de revestimento antes de adicionar mídia de coleta.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Como material de partida neste protocolo que usamos tecido do timo removido crianças submetidas à cirurgia cardiovascular corretiva (Departamento de Cirurgia Torácica e Cardiovascular da Universidade Tuebingen Clinic) obtidos após consentimento informado e sob as diretrizes institucionais. Este material descartado pode variar muito em tamanho 2-30 g ou mais. O número de subconjuntos e mDC TEC (CTEC e Mtec) que são obtidos depende do tamanho assim como da idade da amostra de tecido do timo para o isolamento.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O protocolo aqui descrito é uma modificação do protocolo publicado por Gotter et al 4. As etapas críticas no protocolo são a condição e a preparação inicial do tecido, bem como a separação de densidade de Percoll. É altamente recomendável para processar o tecido, assim que possível após a colheita. É importante trabalhar rapidamente mas cuidadosamente durante a limpeza e corte do tecido. Durante a lavagem de timócitos descrito na etapa 2.3, é crucial para encontrar o equilíbrio certo quando se aplica...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Não há conflito de interesse declarados.

Agradecimentos

Somos gratos aos cirurgiões do Departamento de Cirurgia Torácica e Cardiovascular, Clínica Universitária Tuebingen por nos fornecer as amostras de timo e Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Alemanha) para fornecer o anticorpo CDR2. Gostaríamos também de agradecer a Hans-Jörg Bühring e Sabrina Grimm a partir da instalação de triagem (Universidade de Tuebingen). Este trabalho foi apoiado pelo SFB 685 e da Fundação Hertie.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes e Materiais
RPMI 1640PAAE15-842 
PAAH15-002de Dulbecco 
Soro Fetal Bovino-OuroPAAA15-151 
Albumina de Soro BovinoPAAK41-001 
Colagenase ARoche10 103 586 001 
DNase I, grau II bovino pancreáticoRoche10 104 159 001 
Tripsina-EDTA 10x em PBSPAAL11-001conc. 20 mg/ml
Kit de Rotulagem de Proteínas Alexa Fluor 488Sondas MolecularesA-10235 
anti-humano CDR2 (purificado)Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Alemanhamarcado com Alexa Fluor 488
anti-humano CD45 (Azul Pacífico)Biolegend304022 
EpCAM anti-humano (APC)Miltenyi Biotec130-091-254 
CD11c (PE) anti-humanoMiltenyi Biotec130-092-411
Microesferas anti-PEMiltenyi Biotec130-048-801 
microesferas anti-CD45, humanoMiltenyi Biotec130-045-801 
Colunas LSMiltenyi Biotec130-042-401 
Tubos C gentleMACSMiltenyi Biotec130-093-237para dissociador de tecidos
Percoll (densidade 1.130 g/ml)GE Healthcare, Life Sciences17-0891-01 
Água destilada estéril (livre de DNAse/ RNAse)GIBCO10977-035 
Gamunex 10%Tajecris-BiotherapeuticsG120052pré-diluição 1:10, use 20 μ L / 1 x 106< / SUP>Cells
0,22 μ Filtro MMillex GSSLGS033SSacionada por seringa
MilliporeSCGPU05REPC acionados por bomba
50 mlNalgene3118-0050Tubos
cônicos PP de 50 ml 50 mlBecton Dickinson352070 
Tubos de ensaio de 12 mm x 75 mm 5 mlBecton Dickinson352058Coloração FACS
Filtro de célula 70 μ mBecton Dickinson352350 
INSTRUMENTS
Flow Citômetro-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)Becton Dickinson 
Sorvall Evolution R6 (rotor)Kendro 
Rotator REAX 2Heidolph 
gentleMACS DissociadorMiltenyi Biotec130-093 235dissociador de tecidos
PBS Unidade de filtro Stericup Tubos de centrífuga de carvalho de

Referências

  1. Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
  2. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
  3. Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
  4. Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
  5. Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
  6. Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
  7. Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
  8. Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
  9. Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
  10. Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
  11. Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
  12. Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
  13. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
  14. Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Isolamento CelularDigest o Enzim ticaCentrifuga o por Gradiente de Densidade de PercollSepara o Celular Magn ticaSepara o Celular Ativada por Fluoresc nciaFra o de Baixa DensidadeEnriquecimento Celular

Artigos relacionados