Submillisecond alterações na conformação das proteínas resolvidas por Photothermal Boca deflexão

Resumo

Aqui descrevemos uma aplicação da técnica de deflexão do feixe fototérmica em combinação com um composto de cálcio enjaulado, DM-nitrophen, para monitorar microssegundo e milissegundo dinâmica e energética de mudanças estruturais associadas com a associação de cálcio para um sensor de cálcio neuronal, Downstream Elemento Regulador Antagonista modulador .

Resumo

Deflexão do feixe Photothermal conjunto com foto-acústica calorimetria e ralar térmica pertence à família de métodos fototérmicos que monitorar o tempo de perfil de volume e entalpia mudanças de luz induzidas mudanças conformacionais em proteínas em microssegundos para milissegundo prazos que não são acessíveis através de parada tradicional -fluxo de instrumentos. Além disso, uma vez que as alterações globais de volume e / ou entalpia são sondados, estas técnicas podem ser aplicadas às proteínas e outras biomacromoléculas que carecem de um fluoróforo e um rótulo ou cromóforo. Para monitorar a dinâmica e energética de mudanças estruturais associadas ao Ca ^{2 +} ligação a transdutores de cálcio, tais sensores de cálcio neuronais, um composto de cálcio enjaulado, DM-nitrophen, é empregado para foto-trigger um aumento rápido (τ <20 ms) em cálcio livre concentração eo volume associado e entalpia mudanças são detectados usando feixe fototérmica técnica deflexão.

Introdução

Métodos foto-térmico, como a calorimetria fotoacústica, deflexão do feixe fototérmica (APO), e ralar transitória juntamente com excitação laser de nanossegundos representam uma alternativa poderosa para transitória espectroscopia óptica para estudos resolvido em tempo de curta duração intermediários ^1,2. Em contraste com as técnicas ópticas, tais como a absorção transiente e espectroscopia de infravermelho, que acompanhar o perfil do tempo de alterações de absorção do cromóforo circundante; técnicas fototérmicos detectar o tempo-dependência de alterações de calor / volume e, portanto, são ferramentas valiosas para investigar os perfis de tempo de opticamen....

Protocolo

1. Preparações de amostras

1. Realizar a preparação de amostras e todas as manipulações de amostra em um quarto escuro para evitar uma uncaging indesejada.
2. Solubiliza-DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetoxifenil) - N, N, N ', N'-tetraquis [(oxi-carbonil) metil] -1,2-etanodiamina) em HEPES 50 mM tampão, KCl 100 mM, pH 7,0 para uma concentração final de 400 uM (ε _350nm = 4330 M ^-1 cm ^{-1 9).}
3. Adicionar _CaCl2 a partir da solução de estoque 0,1 M para atingir uma proporção desejável de [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrophen]. Para as proteínas com a K _d para o ^{Ca2 +}....

Resultados

Um exemplo representativo de PBD traça de Ca ^{2 + a} foto-libertação de ^{Ca2 +} DM-nitrophen é mostrado na Figura 3. A fase rápida corresponde à foto-clivagem de Ca ^{2 +} DM-nitrophen e Ca ^{2 +} de libertação, enquanto que a fase lenta reflecte Ca ^{2 +} ligação para a gaiola nonphotolysed. O gráfico da amplitude de PBD amostra para a fase rápida e lenta escalado para a amplitude do composto de referência, em função do factor de dependia da temperatura [C

Discussão

O princípio físico por trás de métodos fototérmicos é que uma molécula foto-animado dissipa o excesso de energia através de relaxamento vibracional para o estado fundamental, resultando em aquecimento térmico do ^1,12 solvente circundante. Para solventes, tais como água, esta produz uma expansão rápida de volume (? V _th). Moléculas em estado animado também podem passar por processos fotoquímicos que resultam em mudanças de volume nonthermal (? V _nonth) devido à ligação clivagem / formação.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1-(4,5-Dimetoxi-2-nitrofenil)-1,2-Diaminoetano-N,N,N',N' -Tetraacetic Acid	Life Technologies	D-6814	DM-nitrofeno, composto de cálcio para gaiola, mantém as soluções de estoque no escuro para evitar a fotodissociação
Ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico, N-(2-Hidroxietil)piperazina-N′ -(ácido 2-etanossulfônico)	Tampão HEPES Sigma Adrich	0909C
Ferricianeto de potássio (III)	de referência Sigma	Aldrich	para medições de PBD
Cromato de sódio	Sigma Aldrich	307831	composto de referência para medições de PBD
Diodo laser He-Ne 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	uso como feixe de sonda para medições de PBD
Osciloscópio,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandwith
Nd:YAG laser	Continuum	ML II	feixe de bomba para medições PBD
M355; Espelho laser Nd:YAG	Espelho laser Edmund Optics	47-324	para linha laser de 355 nm
M1 e M2; Espelho de diodo laser	Edmund Optics	43-532	espelho plano de laser visilbe, faixa de comprimento de onda 300-700 nm
P1 e P2; Diafragma de íris	Edmund Optics	62-649	orifício de pino para moldar a sonda e feixes de pum
L1; lente bi-convexa	Thorlabs	LB1844	uma lente para focalizar o feixe da sonda no detector, EFL 50 mm, faixa de comprimento de onda 350-2.000 nm
DM, espelho dicróico	Thorlabs	DMLP505	um espelho dicróico passa-longo com um comprimento de onda de corte de 505 nm
F1; Filtro de borda	Andower	500FH90-25	um filtro de passagem longa com um comprimento de onda de corte de 500 nm
Suporte de cubeta controlado por temperatura	Quantum Northwest	FLASH 300

Composto 702587