Deformação mecânica rápida de células surgiu como um método promissor, livre do vector para a entrega intracelular de macromoléculas e nanomateriais. Este protocolo fornece etapas detalhadas sobre como usar o sistema para uma ampla gama de aplicações.
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Artigo de método
Espremendo celular como uma plataforma de entrega intracelular Robust Microfluidic
Neste artigo
Resumo
Resumo
Deformação mecânica rápida de células surgiu como um método promissor, livre do vector para a entrega intracelular de macromoléculas e nanomateriais. Esta tecnologia tem mostrado potencial para enfrentar aplicações previamente desafiantes, incluindo, a entrega de pilhas imunes, reprogramação celular, nanotubos de carbono, e entrega ponto quântico. Esta plataforma de microfluidos livre do vector depende de ruptura mecânica da membrana celular para facilitar a entrega citosólica do material alvo. Relata-se o método detalhado de uso para esses dispositivos microfluídicos, incluindo, a montagem do dispositivo, a preparação celular, e operação do sistema. Esta abordagem requer a entrega de uma breve otimização do tipo de dispositivo e as condições de operação para aplicações previamente não-relatados. As instruções fornecidas são generalizáveis para a maioria dos tipos de células e materiais de entrega, este sistema não requer buffers especializados ou etapas modificação química / conjugação. Este trabalho também fornecers recomendações sobre como melhorar o desempenho do dispositivo e de problemas disparar potenciais problemas relacionados com a obstrução, a eficiência de entrega baixos, ea viabilidade celular.
Introdução
A entrega de macromoléculas para o citoplasma da célula é um passo crítico para aplicações terapêuticas e de pesquisa. Nanopartículas de entrega mediada, por exemplo, revelou potencial na terapia de genes de 1,2, enquanto que a entrega de proteína é uma forma promissora de afectar a função celular, tanto clínicas e laboratoriais 3 4 configurações. Outros materiais, tais como medicamentos de pequenas moléculas, pontos quânticos, ou nanopartículas de ouro, são de interesse em aplicações que vão desde o tratamento do câncer de 5,6 para 7,8 rotulagem intracelular, e única molécula de rastreamento 9.
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Protocolo
1. Armazenamento
- Armazene os reservatórios, suportes, anéis de vedação e dispositivos microfluídicos em etanol 70%. Use um recipiente (por exemplo, jarra ou copo) que tem uma tampa para evitar a evaporação e contaminação por poeira ou partículas de fora. Colocar os dispositivos em um recipiente (1), reservatórios e os O-rings em um segundo recipiente (2), e os detentores na terceira (3).
Nota: O uso do etanol de 70% para o armazenamento é manter a esterilidade. Se os únicos componentes da solução são o etanol e água (ou seja, sem agentes de desnaturação), todos os componentes do sistema deve ser totalmen....
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Resultados
A Figura 1 apresenta um esquema descritivo de o sistema de entrega de microfluidos. Figuras 2a-b ilustram os resultados típicos de tratamento de células HeLa com diferentes modelos de dispositivos, na presença de fluorescência 3 conjugado dextrano 20 kDa. Se o procedimento for seguido corretamente, o desempenho do sistema será sensível ao tipo de dispositivo e velocidade de operação. Portanto, deve-se otimizar essas condições para uma determinada aplicação antes de prosseguir.......
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Discussão
Certos aspectos do procedimento experimental descrito (isto é, com excepção de design de chips e a velocidade de funcionamento factores) pode necessitar de ser optimizada, dependendo do tipo de célula e material de entrega que o sistema é aplicado. A discussão que se segue aborda alguns dos fatores mais comuns a considerar ao projetar experimentos.
Para melhorar o sinal de entrega para compostos marcados com fluorescência, é preciso abordar as fontes de fluorescência de fundo. Super.......
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Divulgações
Os autores Armon Sharei, Robert Langer e Klavs F. Jensen são acionistas da SQZ Biotechnologies empresa que produz os dispositivos microfluídicos usados neste artigo.
Agradecimentos
Agradecemos T. Shatova para discussão útil em delineamento experimental e análise de dados. A assistência e competências de G. Paradis, o pessoal da citometria de fluxo do núcleo do Instituto Koch, e os funcionários do Laboratório de Tecnologia Microsystems no Instituto de Tecnologia de Massachusetts estão reconhecido agradecimento. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Grants Saúde RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, e parcialmente pelo Instituto Nacional do Câncer Cancer Center Support (Core) Concede-P30 CA14051 e MPP-09Call-Langer-60.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Suporte do dispositivo e Reservatório de plástico | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Máquina de citometria de fluxo usada nas instalações centrais do Koch Institute |
| Dispositivo microfluídico | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Sistema de pressão para operar o dispositivo | SQZ Biotechnologies | Pinças de sistema | |
| Banho | |||
Referências
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-....
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Reimpressões e permissões
