Artigo de método

Isolamento de celulares lipídicas Gotas: Duas técnicas de purificação Começando a partir de células de levedura e placentas humanas

DOI:

10.3791/50981

⸱

1 de abril de 2014

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Tennessee

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Duas técnicas de isolamento de gotículas lipídicas celulares a partir de 1) células de levedura e 2) placentas humanas estão apresentadas. A peça central de ambos os processos é a centrifugação de gradiente de densidade, onde a camada flutuante resultante contendo as gotículas podem ser facilmente visualizadas por olho, extraiu-se, e quantificada por análise de Western Blot quanto à pureza.

Resumo

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Gotículas lipídicas são organelas dinâmicas que podem ser encontrados na maioria das células procariotas e eucariotas certos. Estruturalmente, as gotículas constituídas por um núcleo de lípidos neutros rodeadas por uma monocamada de fosfolipido. Uma das técnicas mais úteis na determinação dos papéis celulares de gotículas foi identificação proteoma de proteínas ligadas, que podem ser isolados, juntamente com as gotas. Aqui, dois métodos são descritos para isolar gotículas lipídicas e suas proteínas ligadas a partir de duas amplas eucariontes: levedura de fissão e as células das vilosidades da placenta humana. Apesar de ambas as técnicas têm diferenças, o método main - gradiente de densidade centrifugação - é compartilhado por ambas as preparações. Isto demonstra a ampla aplicabilidade das técnicas de isolamento de gotículas apresentados.

No primeiro protocolo, as células de levedura são convertidas em esferoplastos por digestão enzimática das paredes celulares. Os esferoplastos resultantes são então gently lisadas em um homogeneizador folgadas. Ficoll é adicionado ao lisado para providenciar um gradiente de densidade, e a mistura é centrifugada três vezes. Depois da primeira rotação, as gotículas lipídicas são localizadas na camada flutuante de cor branca dos tubos de centrífuga, juntamente com o retículo endoplasmático (ER), a membrana de plasma, e vacúolos. Dois rotações subsequentes são utilizados para remover estes três organelos. O resultado é uma camada que tem apenas gotículas e as proteínas ligadas.

No segundo protocolo, as células das vilosidades da placenta são isolados a partir de placenta humana prazo por digestão enzimática com tripsina e DNase I. As células são homogeneizadas num homogeneizador folgada. De baixa velocidade de centrifugação e de velocidade média passos são usadas para remover as células não quebradas, os detritos celulares, os núcleos, e as mitocôndrias. É adicionada sacarose ao homogenato para providenciar um gradiente de densidade, e a mistura é centrifugada para separar as gotículas lipídicas a partir do outro cellulafracções r.

A pureza das gotículas lipídicas em ambos os protocolos, é confirmada por análise Western Blot. As frações de gotículas de ambas as preparações são adequados para a análise proteômica e lipidomas subseqüente.

Introdução

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Gotículas lipídicas celulares são organelas dinâmicas que servem múltiplas funções nas células. Eles são centros de armazenamento de lípidos neutros, que podem ser convertidas em energia ou utilizadas para a síntese de fosfolípidos. As gotículas de desempenhar um papel central em condições fisiológicas e patológicas, incluindo a aterosclerose, obesidade e doenças metabólicas relacionadas, e também as doenças infecciosas 1,2. Além disso, eles são fontes interessantes para combustíveis de biodiesel.

Muita informação sobre os papéis celulares de gotículas lipídicas foi obtida a partir de análise proteôm....

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Protocolo

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1. Isolando lipídicas gotas de (cisão) Células de levedura

Isolamento de gotículas do organismo modelo popular brotamento Saccharomyces cerevisiae é quase idêntico ao seguinte protocolo 6. As diferenças nas preparações são anotados.

1. Crescer células de levedura

  1. Prepare a mídia. Combine 36 g de YE5S pó por litro de dH 2 O em garrafas de vidro ou frascos de cultura. Serão necessários cerca de 2 L de mídia. Autoclave a mídia a 121 ° C por 20 min. Permita que os meios de comunicação para arrefecer à temperatura ambiente. Para S. cerevisiae substituir YE5S com YPD. ....

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Resultados

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Se a centrifugação em gradiente de densidade funcionou como esperado, a camada flutuante deve conter gotículas lipídicas e ser desprovido de outros organelos toda a progressão dos spins de alta velocidade.

Para Protocolo 1, Western Blot foram realizadas com anticorpos para marcadores gotículas lipídicas (Erg6p) e organelas que foram encontrados para interagir com gotículas lipídicas em levedura, ER (Dpm1p), mitocôndria (Por1p), membrana plasmática (Pma1p), e vacúolos (Vma1p).

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Discussão

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As etapas críticas dentro deste protocolo

Certifique-se para ser consistente com os meios e as densidades celulares durante o crescimento das células em cultura. Gotículas lipídicas celulares são únicos na medida em que as suas proteínas associadas são altamente dependentes do ambiente no qual as células são cultivadas 17. Portanto, os meios de comunicação em que as células são cultivadas e da densidade das células devem ser cuidadosamente m.......

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo prêmio American Heart Association 13SDG14500046 para PD, uma Educação Energia Sustentável & Centro de Pesquisa Award (Univ. of Tennessee) para PD, e de Educação Médica dos Médicos e Fundação de Pesquisa (Univ. of Tennessee) prêmio para JM A autores agradecem Caroline Leplante (Yale Univ.) para o protocolo para a conversão de levedura para esferoplastos; Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) para o uso de suas incubadoras agitação, mesa centrífuga e Western Blot equipamentos de análise, e do Centro de Biotecnologia Ambiental (Univ. Tennessee) para o uso de seu ultra-centrífuga; Günther Daum para anticorpos levedura (Graz Univ of Technology,....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Protocolo 1
1. Crescimento de células de levedura e conversão em esferoplastos
Edinburgh Minimal Media (EMM)Sunrise Science Products2005
Extrato de levedura com 5 suplementos (YE5S)Sunrise Science Products2011YE5S media com 225 mg/ml de cada suplemento: adeninie, histidina, leucina, lisina, uracila. O equivalente para levedura em brotamento seria YPD.
YPD em póSunrise Science Products1875Para S. cerevisiae
SorbitolFisher ScientificBP439
Enzima Lítica de LeveduraMP Biomedicals215352610
Enzimas de Lise de Trichoderma harzianumSigma-AldrichL1412
Zymolayse-20TSunrise Science ProductsN0766391Para S. cerevisiae
BODIPY 493/503InvitrogenD-3922
Lâminas de MicroscópioFisher Scientific12-544-7
Vidro de Cobertura de MicroscópioFisher Scientific12-542-B
Pipeta de transferência de plásticoFisher Scientific137115AM
Frasco
de vidro de 1 LBalão
,
< resistentes>2. Isolamento de gotículas lipídicas de levedura
Tris-HClFisher ScientificBP153
EDTAFisher ScientificBP120
Ficoll 400Fisher ScientificBP525
12-14k Spectra/Por Membrana de DiáliseSpectrumLabs132680
Comprimidos de Coquetel Inibidores de Protease sem EDTARoche Diagnostics11873580001irritante
Homogeneizador Dounce Sigma-AldrichD9938
25 mm x 89 mm (para SW28)Beckman-Coulter355642
12-14k Membrana de Diálise Spectra/PorSpectrumLabs132680
Agitador controlado por temperaturaNew Brunswick ScientificC25KC
Thermo Sorvall Legend XTR centrífugaThermo-Scientific75004521
Rotor de Centrífuga de BaldeOscilante Thermo-Scientific75003607
Fiberlite* F15-6x100y Rotor de Ângulo Fixo75003698Thermo-Scientific
LB-MBeckman-Coulter
SW28 Rotor de UltracentrífugaBeckman-Coulter342204
Protocolo 2
1. Isolamento de células vilosas placentárias
Almofadas descartáveisFisher Scientific23666062
Panela autoclavável (recipiente), 3 LFisher Scientific1336110
Tesouras finas, afiadas, retasFerramentas de Fine Science1406011
London ForcepsFine ScienceTools 1108002
Fórceps de #7b DumontFerramentas1127020
Lâminas de BarbearFisher ScientificS65921
Copo de tela para CD-1Fisher ScientificS1145
40 mesh screen Fisher ScientificS0770
Fisherbrand corantes de células 100 μ mFisher Scientific22363549
150 mm Placas de PetriFisher ScientificNC9054771
NaClFisher ScientificS642
KClFisher ScientificP333
KH2PO4Fisher ScientificP386
Na2HPO 4Fisher ScientificS374
D-GlucoseFisher ScientificD16
HEPESFisher ScientificBP310
2,5% Tripsina 10xInvitrogen15090046
DNase I grau II, de pâncreas bovinoRoche Applied Science10104159001
Soluçãode bicarbonato de sódioSigma-AldrichS8761
Erlenmeyer de 500 ml Copos
de 250 ml Tubos
centrífuga de 15 ml Tubos
de 10 ml Pipetas
de 50 ml Tubos
DMEMInvitrogen11965084
2. Isolamento de gotículas lipídicas de células placentárias vilosas
Tris-HClFisher ScientificBP153
EDTAFisher ScientificBP120
D-SucroseFisher ScientificBP220
Carbonato de Sódio Fisher ScientificBP357
Comprimidos de coquetel inibidores de protease sem EDTARoche Diagnostics11873580001irritante
Homogeneizador Dounce Sigma-AldrichD9938
25 mm x 89 mm (para SW28)Beckman-Coulter355642
Ultra-Clear 14 mm x 89 mm (para SW41)Beckman-Coulter344059
Vidro borossilicato descartável PipetasPasteur Fisher Scientific1367820C
Capuz de segurança biológica Termo-Scientific Banho-maria
Fisher Scientific
Agitador com temperatura controladaNew Brunswick ScientificC25KC
Thermo Sorvall Legend XTR centrífugaThermo-Scientific75004521
Rotor de Centrífuga de Balde OscilanteThermo-Scientific75003607
Ultracentrífuga LB-MBeckman-Coulter
SW28 Rotor de UltracentrífugaBeckman-Coulter342204
SW41 Ti Rotor de UltracentrífugaBeckman-Coulter331336
Western blot
IRDye 680 Cabra Anti-Coelho IgGLI-COR926-68071diluição 1:15.000
IRDye 800CW Cabra IgGLI-COR926-32210diluição 1:5.000
NuPAGE Novex 12% Bis-Tris géisInvitrogenNP0341
Anticorpos primários para Protocolo 1
Erg6ppresente do Dr. G. DaumGraz University of Technology, Áustriadiluição 1:5.000
Dpm1pAbcamab1136864 μ g/ml
Por1ppresente do Dr. G. DaumGraz University of Technology, Áustriadiluição 1:5.000
Pma1ppresente do Dr. G. DaumGraz University of Technology, Áustriadiluição 1:10.000
Vma1p (anti-ATP6V1A)Abcamab1137450,5 μ g/ml
Anticorpos primários para o Protocolo 2
Perilipin 2 (anti-ADFP)Abcamab523552 μ g / ml
CalnexinCell Signaling Technology2679diluição 1:1.000
GM130Biorbytorb40533diluição 1:25
COX IVCell Signaling Technology4850diluição 1:1.000
MEK1Biorbytorb38775diluição 1:50
de 250 ml balões de 2,8 lTubos de Ultracentrífuga Ultracentrífuga Balões de de centrífugaserológicasde centrífugaTubos de ultracentrífuga Tubos de centrífuga Rotor de Ultracentrífuga

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ploegh, H. L. A lipid-based model for the creation of an escape hatch from the endoplasmic reticulum. Nature. 448, 435-438 (2007).
  2. Herker, E. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat. Med....

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Etiquetas

Lipid Droplet IsolationDensity Gradient CentrifugationYeast SpheroplastsPlacental Villus CellsFicoll GradientSucrose GradientWestern Blot AnalysisFluorescence MicroscopyProteomic AnalysisLipidomic Analysis

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