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Artigo de método

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

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DOI:

10.3791/50985

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18 de fevereiro de 2014

 ,  ,  , 
1Fondazione Filarete, 2Department of Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan, 3Neuroscience Institute, National Research Council (CNR), 4Department of Health Science, "Magna Graecia" University of Catanzaro

Neste artigo

Resumo

Descrevem-se os métodos de imagiologia que usamos para investigar a distribuição e a mobilidade das proteínas fluorescentes transfectadas residentes no retículo endoplasmático (ER), por meio da imagem confocal de células vivas. Também analisamos ultraestruturalmente o efeito de sua expressão na arquitetura deste compartimento subcelular.

Resumo

Os lípidos e proteínas em células eucarióticas são continuamente trocadas entre compartimentos celulares, embora estas mantêm a sua composição distinta e funções apesar do tráfego intenso interorganelle molecular. As técnicas descritas neste documento são poderosos meios de estudar proteínas e lipídios e mobilidade tráfico in vivo e em seu ambiente fisiológico. Recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em fotodegradação (FLIP) são amplamente usadas técnicas de imagem em células vivas, para estudar o tráfico intracelular através da via endocítica-exo, a continuidade entre a organelos ou subcompartimentos, a formação de complexos de proteína, e proteína de localização em microdomínios lipídicos, todos os quais podem ser observados sob condições fisiológicas e patológicas. As limitações destas abordagens são principalmente devidos à utilização de proteínas de fusão fluorescentes, e as suas desvantagens potenciais incluem artefatual sobre-expressoíon nas células ea possibilidade de diferenças na dobradura e localização de proteínas marcadas e nativas. Finalmente, como o limite de resolução do microscópio óptico (cerca de 200 nm) não permite a investigação da estrutura fina do ER ou os subcompartimentos específicos que podem se originar nas células sob estresse (ie hipóxia, a administração da droga, a expressão excessiva de transmembrana proteínas residentes ER) ou em condições patológicas, combinamos de imagem de células vivas de células transfectadas cultivadas com ultraestrutural análises baseadas em microscopia eletrônica de transmissão.

Introdução

A descoberta da proteína verde fluorescente (GFP) e suas variantes espectrais, eo desenvolvimento paralelo de microscopia de fluorescência, abriram totalmente novos caminhos para a investigação do comportamento de proteínas nas células. Técnicas como a recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) e perda de fluorescência em fotodegradação (FLIP), que é possível por causa da capacidade intrínseca de fluoróforos para extinguir a fluorescência, sob iluminação intensa, são baseados em imagens ao vivo de células confocal e o uso de transf As proteínas de fusão fluorescentes 1-3. Eles são amplamente utilizados para avaliar não só a localização de proteínas, mas também a sua mobilidade e transporte vesicular, o que pode revelar pistas importantes sobre a sua função 4.

A característica única de células eucarióticas é a presença de compartimentos intracelulares que têm composições de lípidos e de proteínas específicas. Embora organelas são fisicamente isolaed, eles precisam de se comunicar uns com os outros e partes componentes moleculares a fim de manter a homeostase celular. A via secretora garante que as proteínas e lípidos sintetizados no ER chegar ao destino final correcta em que exercem a sua função. Organelas intracelulares também pode ser conectado por sites de contacto dinâmicos que permitem que as moléculas (lipídios) a serem trocadas diretamente entre os compartimentos. Além disso, muitas proteínas têm de montados em grandes complexos heteroméricos ou associada com as espécies de lípidos específicos (jangadas lipídicas / microdomínios), a fim de se tornar funcionalmente activa ou pode ser transportado para o seu destino final. Todos estes aspectos biológicos influenciam grandemente as propriedades cinéticas das proteínas, e podem, portanto, ser adequadamente investigada por meio das técnicas descritas a seguir.

Nosso grupo tem utilizado FRAP e FLIP combinado com microscopia eletrônica, a fim de estudar a arquitetura do ER e seus diferentes subdomínios. O ER é a primeira estação da via secretora e desempenha um papel chave na proteína e lípido de classificação 5. É uma organela altamente dinâmico cujos subdomínios distintos refletem suas muitas funções diferentes (ou seja, proteínas e biossíntese de lipídios e de tráfico, dobradura de proteínas, Ca 2 + armazenamento e liberação, e do metabolismo de xenobióticos). No entanto, embora sejam morfologicamente, espacialmente e funcionalmente distinto, estes domínios são contínuas umas com as outras, e a sua abundância relativa pode ser modificado em células em condições fisiológicas e patológicas. O mais conhecido e domínios geralmente espacialmente segregadas do ER são o envelope nuclear, eo RE liso e áspero, no entanto, nós e outros demonstraram que há estruturas de ER, com uma arquitetura mais elaborada e organização tridimensional em vários tipos de células e tecidos sob condições fisiológicas que podem ser induzidas por meio de estímulos de stress, tais como a hipoxia, a drogaadministração, ou a sobre-expressão de proteínas de transmembrana ER residente 2,6 (e suas referências).

Também se demonstrou recentemente a presença de tais estruturas em modelos celulares de doenças humanas 1,7. Originário da cisternas empilhadas de RE liso, eles receberam o nome coletivo de organizado retículo endoplasmático liso (OSER), em 2003, 6, embora eles também são conhecidos como karmellae, lamelas e cristalóide ER com base em sua arquitetura que, como seu tamanho, pode variar. Depois as células são transfectadas com GFP fundida com a região citosólica de proteínas de ER-residente (TA) (d EGFP-ER) ancorada-cauda, ​​a tendência fracamente dimerização de GFP em trans altera drasticamente a organização e estrutura do ER. FRAP e FLIP experimentos mostraram que d EGFP-ER é livre para difundir dentro OSERs, eo fato de que ela se move a partir da ER reticular ao OSER e vice-versa </ Em> indica que os agregados são contínuas com o ER reticular circundante. Análise ultraestrutural nos permitiu correlacionar os dados de fluorescência com uma descrição detalhada da arquitetura OSER e organização em escala nanométrica: OSERs são sempre composta de pilhas de cisternas emparelhado de RE liso, mas pode ter diferentes formas de organização espacial, como regularmente organizadas sinusoidal arrays ou espirais, ou hexagonais "cristalóides" matrizes tubulares. Estes rearranjos levar a morfologias cúbicos 8 que, como eles foram encontrados em células em condições fisiológicas e 9 seguintes stress como a hipóxia 10, o tratamento de droga 11, e cancro 9, podem ter um potencial significativo como marcadores de ultra-estruturais.

Após esta primeira demonstração utilizando proteínas de fusão de GFP, foram utilizadas experiências de imagiologia para analisar a proliferação de domínios de ER, em resposta aos tratamentos farmacológicos 12, assess a tendência de proteínas fluorescentes para oligomerise nas células 13, e para investigar o papel de um mutante, proteína TA ALS-linked na formação de agregados intracelulares de origem ER que podem ser relevantes para a sua patogenicidade a 1,8. Tem sido sugerido que a formação de agregados intracelulares (que ocorre em muitas doenças neurodegenerativas, 14) pode ser um mecanismo de protecção concebido para evitar que as interacções entre proteínas mutantes tóxicos e os componentes celulares circundantes 15.

O que se segue é uma descrição de uma combinação de métodos de microscopia óptica e eletrônica para investigar construções cujo C-terminal domínios hidrofóbicos são inseridos na membrana do ER, e uma análise de seu comportamento dinâmico e os efeitos de sua sobre-expressão no domínio ER Arquitectura em células em cultura (ver Figura 1 para um fluxograma do protocolo experimental).

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Protocolo

1. Plasmídeo, cultura de células, e transfecção com ER fluorescentes Proteínas

  1. O plasmídeo utilizado no presente estudo consiste de uma versão melhorada de GFP fundida na sua extremidade C-terminal para a região da cauda da isoforma ER de rato do citocromo b (5) (abreviada aqui como B (5)), através de uma sequência ligante. A região de cauda contém toda a sequência (Pro94-Asp134) que permanece associada membrana após a clivagem de tripsina de nativo B (5), incluindo a DTM 17-resíduo (domínio transmembrana), flanqueado por sequências polares a montante e a jusante (UPS e DPS) . O ligante é constituído por o epitopo myc seguido por [(Gli) 4 Ser] 3, e todo o ADNc é inserido nos sítios Hind3-Xba1 do mamífero pCDNA3 vector de expressão. Os detalhes da construção deste plasmídeo foi descrito numa publicação anterior, em que é referido como a GFP-ER 16.
  2. Crescer células COS-7 em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de fetal de soro de bovino, 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina, numa incubadora a 37 ° C e 10% de CO 2.
  3. Transfecção. Placa de 3 x 10 5 células sobre uma lamela de vidro redondo de uma placa de 6 poços e, no dia seguinte, com o sistema de transfecção JetPEI como descrito pelo fabricante. Note-se que o rácio de JetPEI / ADN optimizada foi testada a fim de estabelecer a máxima eficiência de transfecção de acordo com o plasmídeo e linha celular utilizada: no nosso caso, uma JetPEI: proporção de ADN de 2:01 conduz a 70-80% de eficiência de transfecção.

2. Vivo Fluorescência Scanning microscopia confocal

  1. De imagem de células vivas. Coloque a lamela em que as células transfectadas foram semeadas numa câmara de cultura de células de aço de 24 mm lamelas cheios com DMEM w / o vermelho de fenol, suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1% de pen / strep, 25 mM de HEPES , 50 ug / ml de cicloheximida e 1:100 OxyFluor para evitar as amostras de fotodegradação. Um microscop SP5 confocale equipado com uma incubadora de CO 2, com temperatura controlada (37 ° C e 5% de CO 2) é utilizado nas experiências de imagem de células vivas, com d GFP-ER ser visualizada usando um laser de 488 nm e um filtro 525/50 de passagem de banda de emissão.
  2. Recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP). Desenhar uma região de interesse (ROI), correspondente a uma estrutura OSER, e descora usando 20 iterações e uma combinação de 488 nm (100% de um laser de Árgon de 30 mW, correspondendo a 5.5-6 μW na amostra) e 405 nm (60% de 30 mW de diodo laser de 405, o que corresponde a 11,6 μW na amostra) lasers que, em nossa experiência, leva a fotodegradação rápida e eficiente.
  3. Grave a recuperação de fluorescência nas ROIs branqueada, tomando um único quadro a cada 10 segundos por 10 minutos (tempo de pixel = 1,61 ms / px).
  4. Perda de fluorescência na fotodegradação (FLIP). Desenhar um ROI correspondente a uma estrutura OSER, e lixívia, como descrito acima. O branqueamento é repetido a cada 30 seg,e as imagens pós-clareamento são registrados a cada 10 segundos por 30 minutos (tempo de pixel = 1,61 ms / px).
  5. FRAP e análise FLIP. Todas as imagens são analisadas utilizando o software ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html ). Nas experiências de FRAP, a recuperação de fluorescência do ROI branqueada é medida ao longo do tempo e normalizados para a fluorescência total de células branqueadas, que é sempre verificado para ser constante ao longo do tempo.
  6. Para os experimentos FLIP, desenhar um ROI fora do OSER branqueada e abrangendo toda a célula. Medir a intensidade de fluorescência ao longo do tempo e normalizar os níveis de fluorescência de um ROI desenhados em uma célula não branqueada, a fim de corrigir qualquer diminuição na fluorescência provocada pela própria imagem.
  7. Em todas as experiências, subtraído do sinal de fundo (determinado numa zona fora das células) a partir das intensidades de fluorescência das ROI. Finalmente, plotar os resultados usando GraphPad software Prism.

3. Ultraestrutural Análise por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Dada a toxicidade de muitos dos reagentes, todos os procedimentos devem ser efectuados usando um laboratório adequado. casaco e luvas sob uma coifa.

  1. Depois de retirar a lamela do prato de Petri, fixar as restantes células cultivadas na parte inferior do prato como uma monocamada utilizando filtrada glutaraldeído a 2% em tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,4, durante 10 min à temperatura ambiente.
  2. Raspar as células com um raspador de Teflon e transferi-los para tubos de 1,5 ml de Eppendorf. Agregar as células por meio de centrifugação a 9.000 g durante 10 min. Retirar o sobrenadante, adicionar fixador fresco, e deixar durante a noite a 4 ° C.
  3. Lavar os sedimentos com o tampão, então pós-corrigir com uma solução de 1% de tetróxido de ósmio em tampão cacodilato, durante 1 hora à temperatura ambiente.
  4. Enxágüe com água MilliQ, e em bloco mancha com1% acetato de uranila em água destilada por entre 20-60 min.
  5. Desidratar as amostras em série crescente de etanol (70%, 80%, 90%, 100% e 100% durante 10 min cada), e lava-se rapidamente duas vezes em óxido de propileno (15 min cada).
  6. Infiltrar as amostras em uma mistura de óxido de propileno + Epon (1:1) (a partir de 2 horas durante a noite).
  7. Incorporar na resina epoxi Epon curada a 60 ° C durante pelo menos 24 horas.
  8. Seção dos blocos de resina aparadas manualmente usando um ultramicrótomo LEICA UC6 equipado com um diamante faca de 45 ° para obtenção de cortes com espessura de 60-70 nm. Colete as seções 300 grades de cobre de malha.
  9. Corar as secções sobre a grelha com uma solução saturada de acetato de uranilo (20 min) e citrato de chumbo (7 min), lavar as grades por imersão em água bi-destilada, filtrada, e deixar secar à temperatura ambiente.
  10. As grades manchadas são observados usando um Tecnai G2 microscópio eletrônico de transmissão, e as imagens foram captadas com uma bottcâmera CCD om-montado em diferentes ampliações finais (geralmente variando de 6,000-39,000 X).

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Resultados

A Figura 2 mostra um estudo FRAP exemplo de mobilidade da proteína. A mobilidade da proteína d EGFP-ER é demonstrado pela recuperação de fluorescência após a fotodegradação rápida em OSERs branqueadas. Para a análise quantitativa, a meia hora e fração móvel foram obtidos a partir de dados medidos experimentalmente ajustando a seguinte equação monoexponencial:

F (t) = F pós + (F rec-F post) (1-e-t / τ)

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Discussão

Os protocolos e abordagens de imagem descritos neste trabalho foram utilizados para investigar a distribuição e mobilidade das proteínas fluorescentes TA transfectadas residentes no ER de células vivas. Analisamos também o efeito da expressão sobre-destas proteínas na arquitetura deste compartimento subcelular por meio de análises ultra-estruturais.

A combinação de células vivas de imagem confocal e microscopia eletrônica representa é um poderoso meio de investigar as propriedades dinâmicas ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores são gratos a Fondazione Filarete por sua ajuda e apoio na publicação deste artigo. Gostaríamos também de agradecer Centro Europeo di Nanomedicina para o uso do Tecnai G2 microscópio eletrônico de transmissão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dulbecco' s Meio Eagle Modificado (DMEM)Invitrogen41966029
Dulbecco' s Meio de Águia Modificado (DMEM) sem vermelho de fenolInvitrogen31053028
Soro Fetal Bovino (FBS)Invitrogen10270106
Pen/StrepInvitrogen15140-122
L-Glutamina 200 mM soluçãoInvitrogen25030-024
jetPEIPolyplus TransfecçãoPP10110
OxyFluorOxyrase Inc.OF-0005
Glutaraldeído Grau ISigma AldrichG5882
Cacodilato de Sódio TrihidratadoSigma AldrichC0250
Tetróxido de Ósmio 4% soluçãoMicroscopia Eletrônica Ciência19150
Acetato de Uranila Di-hidratadoSigma Aldrich73943
Óxido de PropilenoSigma-Aldrich ligeiramente radioativo82320
EPON kit de meio de incorporaçãoSigma-Aldrich45359-1EA-F
Microscopia EletrônicaCitrato de Chumbo 17800
Centrífuga de bancadaEppendorf5415 D
Microscópio Confocal Espectral Leica MicrosystemsTCS SP5
CO2 Sistema de Incubação de Gaiola de Microscópio OkoLab
Ultramicrótomo Leica MicrosystemsUC6
Faca de diamante DiatomeUltra 45 °
Microscópio Eletrônico de Transmissão FEITecnai G2
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc
Câmara de célula de cultura de aço para lamínula de 24 mmBiociênciaCSC-25
Grades de Microscopia EletrônicaCiência de Microscopia EletrônicaG300Cu
de Ciência Ferramentas de

Referências

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