Engenharia baseada em fibrina construções de tecido de miofibroblastos e de aplicação de restrições e tensão para induzir a organização das células e colágeno (Re)

Summary

Este modelo de sistema começa a partir de um gel de fibrina miofibroblastos povoada que pode ser usado para estudar colagénio endógeno (re) organização em tempo real de uma forma não destrutiva. O modelo de sistema é muito sintonizável, como ele pode ser usado com diferentes fontes de células, aditivos médio, e pode ser facilmente adaptada às necessidades específicas.

Abstract

Conteúdo de colágeno e organização no desenvolvimento de tecidos de colágeno pode ser influenciada por cepas do tecido local e restrição dos tecidos. Engenheiros de tecidos pretendem usar esses princípios para criar tecidos com arquiteturas de colágeno pré-definidos. A plena compreensão dos processos subjacentes exatas de remodelação do colágeno para controlar a arquitetura do tecido final, no entanto, é inexistente. Em particular, pouco se sabe sobre a orientação a (re) das fibras de colagénio, em resposta a alterações nas condições de carga mecânica dos tecidos. Nós desenvolvemos um sistema em modelo in vitro, que consiste em biaxialmente limitados miofibroblastos semeado construções de fibrina, para elucidar ainda mais colágeno (re) orientação em resposta ao i) reversão biaxial para condições de carga estática uniaxiais e ii) carga cíclica uniaxial do biaxialmente constrangido construções, antes e depois de uma mudança de direcção de carga, com a utilização do dispositivo de carregamento FX4000T Flexcell. Time-lapse confocal de imagem é utilizado para visualize colagénio (re) orientação de uma maneira não destrutiva.

Organização celular e colágeno nas construções podem ser visualizados em tempo real, e um sistema de referência interna nos permite mudar as células e estruturas de colágeno para a análise de lapso de tempo. Vários aspectos do sistema do modelo podem ser ajustados, como fonte de células ou a utilização de células saudáveis ​​e doentes. Aditivos podem ser utilizados para elucidar os mecanismos subjacentes a remodelação do colagénio, por exemplo, por adição de MMPs ou bloqueio integrinas. A forma eo tamanho da construção pode ser facilmente adaptada para necessidades específicas, resultando em um sistema modelo altamente ajustável para o estudo de células e colagénio (re) organização.

Introduction

Tecidos cardiovasculares têm uma função de suporte de carga de destaque. Em particular, o conteúdo ea organização das fibras de colágeno na matriz extracelular contribuem para as propriedades de suporte de carga e dominar a força do tecido total ^1. Na engenharia de tecidos condicionado mecânica da construção é usada - geralmente constituídos por (cíclica) regimes esforçando - para melhorar a organização do tecido e propriedades mecânicas ^2,3. Entendimento completo da organização do colagénio induzida por deformação em geometrias complexas para criar tecidos tecidos de colagénio com uma arquitectura predefinida ainda não foi alcançada. Isto é principalmente devido ao nosso conhecimento limitado de remodelação do colágeno nos tecidos em desenvolvimento. Modelos existentes, principalmente, dar informações sobre o resultado líquido final de remodelação do colágeno com o uso de pressão estática ^4-6. Aqui nós fornecemos um sistema modelo altamente ajustável que permite o estudo da organização do colagénio (re) de uma forma em tempo real, em 3D, sob influênciada estirpe estático ou cíclico. As construções de tecido são à base de fibrina, assegurando que toda colagénio no construto é endógena. Organização celular e colágeno nas construções é visualizado, e um sistema de referência interna nos permite mudar as células e estruturas de colágeno para a análise de time-lapse. Neste protocolo, iremos descrever o uso do sistema de modelo de veia safena Humanos Células (HVSCs), uma vez que estas células são conhecidos pela sua produção aumentada de matriz extracelular e capacidade para remodelar a matriz e a utilização conhecida em engenharia de tecidos cardiovasculares ^7, baseado na obra de Jonge et al. ^oito

Protocol

1. Cultura de células humanas veia safena

1. Isolar células da veia safena magna, adquirido a partir de um doador de acordo com as orientações para utilização de material secundário, de acordo com o protocolo de Schnell et ai. ⁹ e armazená-las em azoto líquido. A partir da parte da veia safena magna peças cortadas a partir de um doador de 2 x 2 mm a cultura numa placa de seis poços. Use dois pedaços por poço. Geralmente, as células podem ser obtidas suficientes para encher frascos com cerca de 3 0,25 x 10 ⁶ células em azoto líquido. HVSCs são caracterizados como miofibroblastos, mostrando a expressão de vimentina, sem expressão da desmina e uma subpopulação expressando α actina de músculo liso ^10. Ainda iniciar o protocolo para descongelar as células a partir do azoto líquido para aumentar o número de células.
2. Colocar as células a partir de um frasco para dentro de um frasco de cultura de tecido T75 e adicionar meio de crescimento (GM), consistindo de DMEM avançada, 50 ml de soro fetal bovino (FBS), 5 mL de penicilina /estreptomicina e 5 ml de L-Glutamax. Mudar meio cada 2-3 dias.
3. Células crescem confluente aproximadamente após 14 dias. Loja 0,5 x 10 ⁶ células num frasco em azoto líquido, referido como uma passagem.

Nota: Congelamento das células não é necessária quando a colheita HVSCs, mas é usado apenas para armazenamento.

4. Coloque os HVSCs de um frasco em frasco de cultura de um T175 tecido e adicione GM. Mudar meio cada 2-3 dias. Células crescem confluentes após cerca de 7 dias. Loja 3 x 10 ⁶ células em um frasco em nitrogênio líquido, conhecido como passagem 2.
5. Coloque as células de um frasco em uma rollerbottle e adicione GM. Mudar meio cada 2-3 dias. Células crescem confluente aproximadamente após 8 dias. Uma rollerbottle contém cerca de 20-30 x 10 ⁶ células. Células de cultura até a passagem 6. Não usar células de uma passagem superior a passagem 9, uma vez que o fenótipo celular pode mudar.

2. Engenharia de construções de tecido à base de Fibrina

1. Prepare a cola de silicone por mistura do elastómero com o agente de cura (10:1). Corte 7 x 3 segmentos retangulares mm de velcro. Cole o velcro em uma placa de cultura de 6 bem, com membranas flexíveis para formar uma cruz, e deixar um espaço quadrado de 3 mm entre as tiras de velcro.

Notas: Só use o lado macio do velcro e enfrentar este lado para cima. Ao colar o velcro, apenas cobrir o velcro com cola de silicone, não espalhe cola por todo o bem. Uma vez que as placas de cultivo têm fundo da membrana de silicone, usar algo debaixo da placa bem para reforçar as membranas flexíveis, para assegurar a facilidade de colagem para a placa.

2. Seca-se a cola de silicone durante a noite num forno a 60 ° C para assegurar o endurecimento da cola. Esterilizar por adição de EtOH a 70% aos poços e incubar durante 30 min. Lavar 3x com PBS e remover todo o PBS do wells eo velcro. Colocar sob UV, durante 30 minutos e mantenha estéril até à sua utilização.
3. Prepara meio de Engenharia de Tecidos (TM), que consiste em GM e 130 mg de ácido L-ascórbico 2-fosfato.
4. Adicionar 1 mg / mL de ácido amino-capróico ε (ACA) para o TM. ACA é utilizado para os primeiros 7 dias de cultura para evitar a degradação de fibrina a partir de ^11. Alternativamente, a aprotinina pode ser usado.
5. Para evitar a formação de touceira, permitir fibrinogênio atingir a temperatura ambiente antes de abrir. Sem aglomerados fibrinogénio irá dissolver mais facilmente. Dissolve-se o fibrinogénio com uma concentração de 10 mg real de proteína / ml TM ⁷ suplementado com ACA. Filtro estéril a solução de fibrinogênio, vários filtros podem ser necessários. Guarde em gelo até o uso.

Nota: Para dissolver mistura de fibrinogénio com cuidado para evitar a formação de espuma muito.

6. Dissolve-se trombina para uma concentração de 10 Ul / ml TM ⁷ suplementado com ACA. Guarde em gelo até o uso.

Nota: Armazenamento em gelo é necessário para evitar a gelificação precoce de trombina eo fibrinogênio.

7. Trypsinize as células, ressuspender em GM e contagem.
8. Usar 15 x 10 ⁶ células / ml para semear as construções de tecido à base de fibrina (concentração com base em métodos de engenharia de tecidos de válvulas cardíacas ^7). Um único gel consiste em 100 ul de gof el e, assim, de 1,5 x 10 ⁶ células. Colocar 1,5 x 10 ⁶ células num tubo de centrífuga, resultando em tantos tubos de centrifugação como o número de geles que serão feitas.
9. Centrifugar as células a 350 xg durante 7 minutos e descarta-se o sobrenadante. Ressuspender as células em 50 ul de trombina. Adicionar 4 ml de azul fluorescente microesferas de poliestireno a esta suspensão. Colocar 50 mL de fibrinogénio num frasco. Usar uma pipeta para assumir a trombina 50 uL de células. Aumento do volume da pipeta de 100 uL. Pipete 50 pi da solução de trombina comcélulas no frasco com o fibrinogênio para misturar a trombina eo fibrinogênio, e levar até a mistura de 100 ml.

Nota: A fluorescente microesferas de poliestireno são utilizados como marcadores de referência internos para análise de imagem. Quando a mistura de trombina e fibrinogénio, evitar a formação de bolhas de ar, pipetando cuidadosamente a mistura. As bolhas de ar resultará em furos no gel de fibrina.

10. Pipeta a mistura de gel dentro e entre as tiras de velcro. O tempo típico para a gelificação do gel de fibrina, uma vez que os componentes são misturados, é da ordem de 20 segundos.

Notas: Para fazer isso, o mais rapidamente possível para evitar a gelificação antes da mistura é pipetados na placa bem. Pratique antes de usar células e miçangas.

11. Incubar as suspensões durante 30 minutos a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% / 5% de CO ₂ incubadora para permitir a gelificação antes de adicionar a cultura TM com ACA.
12. Substitua TM com ACA cada 2-3 dias para os primeiros 7 dias. Géis são estáveis ​​o suficiente depois de uma semana a ser cultivadas sem ACA. Depois da primeira semana TM substitua cada 2-3 dias. Adicionar 6 ml de TM por poço. No dia 12 células produziram colágeno suficiente para visualização.

3. Aplicando tensão e induzir mudanças no Strain e Restrições

1. Estirpe estático é aplicado directamente pelas células, devido à tracção e célula de compactação ^12. Para induzir a reorganização do colágeno, cortar o tecido construir solta de duas tiras de velcro em uma direção. Isto resulta em limitações unidireccionais (Figura 1A). Executar esta no dia 12, uma vez que a construção é então suficientemente estável e colagénio tenha sido depositado.
2. Aplicar a tensão cíclica mediante a aplicação de vácuo ao fundo das placas de cultura com membranas flexíveis, com a utilização do sistema FX4000T Flexcell. Colocar as placas em uma placa de base, em cima dos postos de carregamento (que são uma parte do diae dispositivo de carga cíclica). A aplica-se uma bomba de vácuo sobre a membrana e, assim puxa a membrana sobre o posto rectangulares encontra-se por baixo. Devido aos elementos de montagem em forma de cruz no tecido constrói à membrana (por intermédio do velcro) e o posto rectangulares da estirpe cíclico aplicado é uniaxial (Figura 1B).
3. Inicialmente, usar cultura estática, durante 5 dias para atingir a integridade mecânica inicial, antes da aplicação da estirpe cíclico, começando no dia 6. Programa de um protocolo de mancha cíclico para o controlador para a bomba de vácuo. Por exemplo, usar um protocolo estirpe cíclico intermitente previamente estabelecida, com o sentido ¹³ uniaxial. Este é constituído por uma estirpe intermitente de uma onda sinusoidal com uma Hz, esticando de 0 a 5% de deformação, por períodos de 3 horas, alternadas com períodos de descanso 3 hr. Realizar esse protocolo tensão cíclica por 7 dias, induzindo uma organização de colágeno alinhados.
4. Tipicamente, após 12 dias HVSCs ter produzido uma organizatio colagénio alinhadosn. Depois de uma organização do colagénio alinhado é atingido, mudar a direcção de tensão uniaxial cíclico, para ser perpendicular à direcção da tensão inicial. Para fazer isso, transformando os cargos retangulares em 90 °.

4. Visualizando Células e colágeno

1. Para visualizar ativa, remodelação do colágeno em tempo real, as amostras de etiquetas com sondas que não interferem com a viabilidade das células ou a formação de colágeno. Use sondas de mancha fluorescente do citoplasma da célula e colágeno.
2. Alternativamente segunda geração harmónica utilizando a microscopia confocal a laser pode ser usada para visualizar as estruturas de colagénio utilizando autofluorescência ^14, com excitação a 780 nm e entre 500-550 nm de detecção.
3. Retire as placas de cultura a partir da configuração e da incubadora, para as amostras ciclicamente tensas durante o período de descanso de 3 horas, e transportá-los para um microscópio de varredura a laser confocal para visualizar as células e colágeno.

Results

Este modelo de sistema permite a cultura myofibroblast-semeados gel de fibrina. Figura 1A mostra um tecido cultivado pela primeira vez sob restrições biaxiais estáticas. Constrangimentos de tecido são libertadas por corte do gel de fibrina a partir de duas restrições, para criar restrições estáticas uniaxiais e compacta do tecido e remodela depois (Figura 1A). Para estirpe cíclico, o tecido é cultivada sob constrangimentos biaxiais estáticos também. Após 5 dias de tensão uniaxial cíclic...

Discussion

O sistema modelo descrito de construções de fibrina por células povoadas tem um grande potencial para o estudo de células e colagénio (re) organização (De Jonge et ai. ^15), por exemplo, para ser utilizado para fins de engenharia de tecidos. Ao usar fibrina, como o transportador inicial da célula, depois da degradação da fibrina, um tecido é criado com apenas células e matriz endógena. Desta forma, as células são estimuladas para reagir à tensão, estático ou de natureza cíclica, pela aplicaçã...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plástico de cultura	Greiner		Inclui frascos de cultura e pipetas
Advanced DMEM	Gibco	12491
Soro bovino fetal	Greiner	758075
Penicilina/estreptomicina	Gibco	10378016
GlutaMax	Gibco	35050-079
Elastômero e agente de cura	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
Velcro	Loja		Você pode comprar isso em uma loja regular, use apenas as
placas de cultura Bioflex	Flexcell Int	BF-3001U
Ácido L-Ascórbico Não Tratado 2-fosfatase	Sigma	A8960
ε-Amino Capróico Ácido	Sigma-Aldrich	D7754
Trombina bovina	Sigma	T4648
Fibrinogênio bovino	Sigma	F8630
0.45 filtro de seringa	Whatmann (Schleicher e Scheul)	10462100
Microesferas de poliestireno	Invitrogen	F-8829	Azul fluorescente, 10 μ m de diâmetro
Flexcell FX-4000T	Flexcell Int		Inclui postes de carga retangulares
Cell Tracker Orange	Invitrogen Molecular Probes	C2927
CNA35-OG488			Cordialmente fornecido pelo Laboratório de Química Macromolecular e Orgânica, Departamento de Engenharia Biomédica, Universidade de Tecnologia de Eindhoven
Microscópio confocal de varredura a laser	Carl Zeiss		LSM 510 Meta e modo Two-Photon-LSM
Anfotericina	Gibco	15290-018	Necessário para isolamento celular