Um método aperfeiçoado para a preparação de colágeno tipo I Da Pele

Resumo

Procedimentos tradicionais para o isolamento do tipo solúvel 1 colágeno (col1) requerem cerca de 10 dias do início ao fim por causa de incubações tampão longas e trabalhosas resuspensions de fibrilas. Aqui, nós descrevemos um meio para purificar a partir de pequenas biópsias COL1 dérmicos em menos de 3 horas.

Resumo

Tipo 1 Solúvel colagénio (COL1) é amplamente utilizado como um substrato adesivo para culturas de células e como um andaime para aplicações de regeneração celular. Clinicamente, esta proteína é amplamente utilizado para a cirurgia estética, injeções dérmicas, enxerto ósseo e cirurgia reconstrutiva. As fontes de COL1 para estes processos são geralmente não-humanos, o que aumenta o potencial para a inflamação e a rejeição, bem como a transmissão da doença de xenobióticos. Em vista disto, um método eficiente e rápido para purificar COL1 de quantidades limitadas de tecidos autologously derivados iria contornar muitos destes problemas, no entanto, os protocolos de isolamento convencionais são demorados e muitas vezes necessitam de grandes quantidades de tecidos colagenosos. Aqui, demonstramos um método de extracção COL1 eficiente que reduz o tempo necessário para isolar e purificar a proteína a partir de cerca de 10 dias para menos de 3 horas. Escolhemos a derme como a fonte de tecido devido à sua disponibilidade durante muitos procedimentos cirúrgicos. Tseu método usa buffers de extração tradicionais combinados com agitação vigorosa e filtração centrífuga para obter altamente pura, COL1 solúvel de pequenas quantidades de cório. Resumidamente, as biópsias da derme são lavados em gelada _dH2O após a remoção de gordura, tecido conectivo, e cabelo. As amostras de pele são retirados de proteínas e polissacarídeos noncollagenous usando 0,5 M de acetato de sódio e uma alta velocidade de bancada homogeneizador. O colagénio de sólidos residuais é subsequentemente extraído com um tampão de citrato de sódio 0,075 M com o homogeneizador. Estes extractos são purificados usando 100.000 MW de corte filtros centrífugos que produzem preparações COL1 de qualidade comparável ou superior aos produtos comerciais ou aquelas obtidas através de procedimentos tradicionais. Prevemos que este método vai proporcionar a utilização dos derivados de autologously COL1 para uma multiplicidade de pesquisa e aplicações clínicas.

Introdução

Durante décadas, os investigadores e os fornecedores comerciais isolaram COL1 solubilizado a partir de uma variedade de fontes de tecidos, incluindo a pele e tendões usando uma variação de um protocolo de extracção de ácido simples, seguido de neutralização, o que resulta numa libertação de uma matriz de fibrilas COL1 organizados que podem ser utilizados para uma infinidade de aplicações biomédicas ^1-4. Embora existam muitos exemplos de aplicações clínicas para COL1, alguns deles empregam COL1 autologously derivados porque a preparação desta proteína requer longas extrações levando dias ou semanas para realizar ^5-7. Como resultado, os investigadores e médicos investigação utilizam geralmente caros, preparações comerciais de COL1 que são preparados usando os tecidos não-humanas, tais como rato, bovino, porcino ou cório ou usando pele retiradas de cadáveres ou depois da circuncisão masculina. Para aplicações regenerativas, muitos destes produtos apresentam variabilidade no que diz respeito à sua capacidade para formar sólidomatrizes ou construções de tecidos capazes de suportar a ligação de células e o crescimento. Por conseguinte, existe uma grande necessidade de um novo método normalizado concebido para extrair rapidamente COL1 a partir de fontes de tecidos autólogos acessíveis e abundantes.

Tal método poderia economizar tempo e dinheiro no ambiente de pesquisa, onde COL1 poderia ser extraído do modelo animal de interesse e utilizado para testes pré-clínicos de tecidos artificiais montados em andaimes à base de colágeno. Ao mesmo tempo, ter a opção de usar um rapidamente isolada, COL1 autologously derivado na clínica seria aumentar a segurança geral dos pacientes que, de outra forma recebem alogénicas ou xenogénicas preparações. Para os pacientes que receberam uma preparação autogeneic, este método simplificado seria reduzir bastante o intervalo entre a coleta de biópsia e aplicação de colágeno. Por estas razões, buscamos aperfeiçoar um método de isolamento e purificação COL1 estabelecido há muito tempo usando ag de alta velocidadeacreditação e de exclusão de tamanho de centrifugação. Este método é simples de executar, usando soluções padrão e equipamentos encontrados em muitos laboratórios. Ao empregar a agitação de alta velocidade, o nosso protocolo reduz o tempo necessário para isolar solúvel, dérmica COL1 de aproximadamente 10 dias para menos de 3 horas ^8. Importante, este método pode ser facilmente realizada no cenário clínico, a fim de preparar COL1 autologously-derivado para utilização em doentes durante um único conjunto de procedimentos.

Protocolo

Aqui vamos demonstrar o isolamento de COL1 de pele de cordeiro. Como escrito, este protocolo pode também ser utilizado com êxito para isolar COL1 de coelho e pele humana.

1. Prepare dérmica Amostra

1. Equilibrar todos os reagentes a 4 ° C antes de usar.
2. Lavar amostra dérmica (25-50 g) em gelada dH ₂ O e remover qualquer lã, pele, cabelo ou com creme depilatório.
3. Use uma lâmina de barbear de ponta única para raspar a limpo amostra de tecido conjuntivo e de gordura.
4. Lavar a amostra em gelada dH ₂ O.
5. Corte a amostra de pele em 1 cm x 1 centímetro pedaços com uma lâmina de barbear de ponta única.

2. Remover noncollagenous solubilizado de materiais

1. Pesar 5 g de amostra por tubo de 50 ml e adicionar 30 ml de 0,5 M de acetato de sódio gelada.
2. Misturar os tubos durante 1 minuto na configuração 6 m / seg utilizando uma placa de tubo de 50 ml no homogeneizador de bancada.
3. Descarte supernatant e repita para um total de 7 ciclos de lavagem de acetato de sódio.
4. Lavar a amostra em gelada dH ₂ O e misture uma vez para remover o acetato de sódio residual.
5. Usar uma espátula para comprimir a amostra de encontro ao lado do tubo para remover o excesso de líquido e, em seguida, transferir para um tubo de 50 ml fresco.

3. Colágeno tipo I Extração

1. Tampão citrato de lavar a amostra duas vezes em 2 ml / g de sódio 0,075 M, durante 1 min a 6 m / s na bancada homogeneizador comprimindo a amostra e descartando o sobrenadante depois de cada lavagem.
2. Adicionar a 2 ml / g nova porção de tampão de citrato de sódio 0,075 M à amostra.
3. Realizar 6 seqüencial 1 min, 6 m / s ciclos de bancada mix homogeneizador de agitação, sem retirar o tampão entre cada ciclo.
4. Transfira a espessura, o sobrenadante claro para um tubo de coleta.
5. Adicionar um tampão de citrato de sódio 0,075 M adicional de 1 ml / g para a amostra e realizar uma última bancada homogeneizador agitaciclo ção.
6. Adicionar este sobrenadante final para um tubo de recolha.
7. Centrifuga-se o tubo de colheita de 3.200 xg durante 10 min a 4 ° C.
8. Transferir o sobrenadante para o topo do compartimento de um peso molecular de 100.000 cortado dispositivo de filtração centrífuga.
9. Centrifugar a 3.200 xg durante 30 min a 4 ° C.
10. Transferir a COL1 purificada a partir do compartimento superior para um tubo cónico limpo e armazenar a 4 ° C.

Resultados

Este protocolo de isolamento COL1 requer cerca de 2 horas e 15 minutos para ser concluído. A Figura 1 mostra um diagrama esquemático que representa as principais etapas deste processo. Preparação da amostra e realizando os 7 ciclos de agitações de alta velocidade e lavagens com acetato de sódio leva cerca de 35 minutos (Figuras 1A-C). Realizando uma agitação e enxágüe ciclo com _dH2O demora cerca de 5 min (Figuras 1D e 1E). A adição de citrato de sódio e subme...

Discussão

Um componente importante do presente método é a compressão eficaz repetida da amostra cutânea para remover o excesso de líquido. É essencial para remover tanto quanto possível, de acetato de sódio no passo de 2,5 por compressão da amostra. Usamos uma espátula para compactar a pele contra o lado do tubo, no entanto, gaze também pode ser usado, embora isto exigir a remoção da amostra do tubo e aumentar o tempo necessário para realizar estes passos. Da mesma forma, é importante para comprimir a amostra no passo 3.1, de mod...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema FastPrep-24	MP Biomedicals	116004500
Centrífuga	Beckman	J6-MI	Rotor de caçamba oscilante para acomodar tubos cônicos de 50 ml a 3.200 x g.