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Nanopartículas de PLGA formadas por emulsão simples ou dupla com vitamina E-TPGS

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DOI:

10.3791/51015

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27 de dezembro de 2013

 , 
1Barrow Brain Tumor Research Center, Barrow Neurological Institute

Neste artigo

Resumo

Descrevemos a produção e caracterização de nanopartículas e micropartículas compostas por poli(ácido lático-co-glicólico) utilizando a vitamina E-TPGS como emulsificante. Variando os parâmetros de formulação, como a concentração do emulsificante, é possível produzir nanopartículas com diâmetros médios que variam de 220 nm a 1,98 μm.

Resumo

Poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) é um membro biocompatível da família de polímeros biodegradáveis de poliéster alifático. O PLGA tem sido uma escolha popular para aplicações de administração de medicamentos, principalmente porque já é aprovado pela FDA para uso em humanos na forma de suturas reabsorvíveis. Drogas hidrofóbicas e hidrofílicas são encapsuladas em partículas de PLGA por meio de emulsão simples ou dupla. Resumidamente, o medicamento é dissolvido com polímero ou emulsionado com polímero em uma fase orgânica que é então emulsionada com a fase aquosa. Após a evaporação do solvente, as partículas são lavadas e coletadas por centrifugação para liofilização e armazenamento de longo prazo. O PLGA se degrada lentamente por hidrólise em ambientes aquosos, e os agentes encapsulados são liberados durante um período de semanas a meses. Embora o PLGA seja um material que possui muitas vantagens para a administração de medicamentos, a formação reprodutível de nanopartículas pode ser um desafio; Considerável variabilidade é introduzida pelo uso de diferentes equipamentos, lote de reagentes e método preciso de emulsificação. Aqui, descrevemos detalhadamente a formação e caracterização de micropartículas e nanopartículas formadas por emulsão simples ou dupla usando o agente emulsificante vitamina E-TPGS. A morfologia e o tamanho das partículas são determinados com microscopia eletrônica de varredura (MEV). Fornecemos imagens SEM representativas para nanopartículas produzidas com concentração variável de emulsificante, bem como exemplos de artefatos de imagem e emulsificações com falha. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para usar emulsificantes alternativos (por exemplo, poli(álcool vinílico), PVA) ou solventes (por exemplo, diclorometano, DCM).

Introdução

Os polímeros tornaram-se veículos de administração de medicamentos cada vez mais populares nas últimas décadas para aplicações que vão desde a terapia direcionada de tumores1 até a modulação do sistema imunológico2. Os medicamentos encapsulados ou conjugados com polímeros são frequentemente mais eficazes do que seus equivalentes entregues livremente, uma vez que o medicamento associado ao polímero é protegido contra degradação. Essa proteção se traduz em uma meia-vida biológica mais longa e eficácia potencialmente melhorada com efeitos colaterais sistêmicos reduzidos3-5.

Poly(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) exibe muitas das propriedades ideais de um sistema de entrega em nanoescala, proporcionando liberação a longo prazo do agente encapsulado e degradando-se nos produtos biocompatíveis de ácido lático e glicólico. Pequenas moléculas, proteínas e ácidos nucléicos encapsulados em PLGA demonstraram atividade aumentada em uma variedade de aplicações de doenças8. É importante ressaltar que a plataforma de materiais facilita a personalização fácil de recursos como tamanho, carga e exibição de superfície de ligantes para direcionar partículas para tecidos específicos ou para fins de imagem. Como o PLGA já é usado em humanos na forma de suturas biodegradáveis (por exemplo, Purasorb, Purac Biomaterials e Vicryl, Ethicon Inc.), o potencial de tradução clínica é alto.

A emulsão óleo-água (simples) ou água-óleo-água (dupla) é um método pelo qual o PLGA pode ser usado para encapsular drogas hidrofóbicas e hidrofílicas em micro ou nanoescala Resumidamente, o PLGA é dissolvido em uma fase orgânica (óleo) que é emulsionada com um surfactante ou estabilizante (água). Os medicamentos hidrofóbicos são adicionados diretamente à fase oleosa, enquanto os medicamentos hidrofílicos (água) podem ser primeiro emulsionados com a solução polimérica antes da formação das partículas. As explosões de sonicação de alta intensidade facilitam a formação de pequenas gotículas de polímero. A emulsão resultante é adicionada a uma fase aquosa maior e agitada por várias horas, o que permite que o solvente evapore. As nanopartículas endurecidas são coletadas e lavadas por centrifugação (Figura 1).

Aqui, descrevemos uma técnica para confecção de nanopartículas de PLGA utilizando emulsão simples e dupla, com acetato de etila (EtAc) como solvente e succinato de polietilenoglicol de vitamina E-D-α-Tocoferol (TPGS) como agente emulsificante. O uso de vitamina E-TPGS oferece várias vantagens possíveis sobre outros tipos de agentes estabilizadores (por exemplo, poli (álcool vinílico), PVA), incluindo emulsificação aprimorada e eficiência de encapsulamento. Outros grupos relataram vantagens da vitamina E-TPGS, incluindo a inibição da P-gp, uma proteína de efluxo transmembrana, que é comumente superexpressa em células cancerígenas e conhecida por contribuir para a resistência aos medicamentos, transportando os medicamentos para fora das células-alvo. Além disso, demonstramos como caracterizar e dimensionar as partículas usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e fornecemos mais orientações sobre a modificação de tamanho por meio da alteração do protocolo.

Protocolo

1. Preparação de nanopartículas

Todas as etapas envolvendo solvente ou polímero dissolvido/emulsionado devem ser executadas em uma capela de exaustão química.

  1. Pesar 100 mg (+/- 5 mg) de poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA) e colocar num tubo de ensaio de 13 mm x 100 mm.
  2. Transferir 1 ml de solvente [acetato de etilo (EtAc) ou diclorometano (DCM)] para a amostra com uma pipeta serológica de vidro.
  3. Cubra a parte superior do tubo com um pequeno pedaço de papel alumínio e coloque o filme com parafilme firme, certificando-se de enrolar o parafilme firmemente na borda superior do frasco, bem como na borda inferior do papel alumínio.
  4. Marque o nível do solvente na parte externa do tubo de ensaio. Deixe o polímero dissolver durante a noite, adicionando solvente adicional no dia seguinte se ocorrer evaporação.
    Nota: O polímero também pode ser dissolvido no dia da preparação da nanopartícula, se necessário. Siga as etapas 1.1-1.3 e, em seguida, bata em alta até que todo o polímero esteja completamente dissolvido (~ 10 min).
  5. Preparar uma área de trabalho na hotte com os seguintes equipamentos/materiais junto ao ultrassónico: um vórtice, duas pequenas pipetas Pasteur de vidro com lâmpadas de borracha e uma placa de agitação magnética. Coloque um copo grande cheio de água gelada em um suporte abaixo do ultrassom.
  6. Adicione 45 ml de vitamina E-TPGS a 0,3% p/v a um copo de vidro de 200 ml com uma barra de agitação magnética e ajuste a velocidade de agitação para 360 rpm.
  7. Adicione 2 ml de vitamina E-TPGS a 0,3% p/v a um tubo de ensaio de vidro de 13 mm x 100 mm.
  8. Adicionar medicamento:
    Para agentes hidrofóbicos: adicione encapsulante diretamente à solução polimérica (tomando cuidado para evitar as paredes do tubo de ensaio) e vortex o tubo até que o encapsulante esteja homogeneamente disperso.
    Para agentes hidrofílicos: emulsionar o encapsulante com a solução polimérica antes de prosseguir. Adicione até 50 μl de medicamento em água ou tampão à superfície da solução polimérica. Ultrassonicar brevemente para emulsionar o medicamento com polímero (normalmente 10 segundos ou conforme necessário para obter uma solução homogênea e opaca). Esta etapa de sonicação deve ser realizada no gelo.
  9. Coloque o polímero/encapsulante de tubo aberto próximo ao vórtice. Enquanto segura o tubo de ensaio contendo vitamina E-TPGS verticalmente e em vórtice alto, use uma pipeta de vidro Pasteur para adicionar a solução de polímero / encapsulante gota a gota. Tenha cuidado para evitar as laterais do tubo e soltar a solução de polímero diretamente na superfície do emulsificante de vórtice. Depois que todo o 1 ml de solução de polímero tiver sido adicionado ao TPGS de vitamina E, continue agitando a solução (agora uma emulsão) por mais 15 segundos.
  10. Transfira imediatamente o polímero emulsionado para o ultrassom. Mantenha o tubo de ensaio imerso em água gelada e sonice a emulsão em três rajadas de 10 segundos (amplitude de 40% para um sonicador de 700 W, tamanho da ponta da sonda de 1/8 pol.). Mova a emulsão para cima e para baixo na sonda para garantir uma sonicação uniforme, tomando cuidado para evitar tocar na sonda nas laterais ou no fundo do tubo de ensaio. Faça uma pausa entre cada sonicação de dez segundos para permitir que a solução esfrie antes de prosseguir.
  11. Adicione 1-2 ml de Vitamina E-TPGS a 0,3% da solução de agitação à emulsão com uma pipeta Pasteur de vidro, que dilui o polímero emulsionado para que ele seja derramado mais facilmente. Esvazie a emulsão na solução de agitação. Repita esta etapa para lavar qualquer solução restante do tubo de ensaio para a solução de agitação.
  12. Deixe as nanopartículas endurecerem enquanto mexe por três horas. Se o encapsulante for sensível à luz, o béquer pode ser envolto em papel alumínio, deixando a parte superior aberta para facilitar a evaporação do solvente.

2. Coleta de nanopartículas

  1. Divida as nanopartículas endurecidas em dois tubos de centrífuga Oak Ridge (volume nominal de 30 ml) e equilibre com 0,1 g.
  2. Centrifugue as nanopartículas em um rotor de ângulo fixo por 15 min a 17.000 x g. Tempos de centrifugação mais longos resultarão na coleta de uma fração maior de nanopartículas menores.
  3. Descarte o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet de nanopartículas (a água pode ser derramada ou pipetada). Adicionar 15 ml de diH2O e utilizar um sonicador e/ou vórtice em banho-maria para ressuspender completamente as nanopartículas.
  4. Combine o conteúdo dos dois tubos de centrífuga em um e repita as etapas 2,1-2,3 2x mais, para um total de três lavagens em 30 ml de diH2O de cada vez. O volume de fluido da última ressuspensão do pellet deve ser de 4-5 ml.
    Uma proporção de peso de 1:2 trealose:polímero pode ser adicionada neste ponto como um crioprotetor (congelar uma pequena alíquota de nanopartículas sem trealose para imagens de MEV). Os cristais de gelo que se formam durante o processo de congelamento podem danificar a superfície da partícula e induzir a agregação, e a inclusão de trealose demonstrou melhorar a ressuspensão uniforme e completa das nanopartículas de PLGA13.
  5. Transferir as nanopartículas para um tubo de centrifugação de 5 ml previamente pesado e congelar a -80 °C durante um mínimo de 30 min.
  6. Movendo-se rapidamente para não deixar o conteúdo congelado derreter, destampe o tubo e cubra a parte superior prendendo o tecido de laboratório na parte superior com um elástico. ** Se ocorrer algum derretimento, congele novamente antes de colocar no liofilizador.
  7. Liofiliza 72 horas para um volume de 5 ml. Armazenar as partículas liofilizadas em tubo envolto em parafilme a -80 °C.

3. Dimensionamento e morfologia da superfície

Microscopia Eletrônica de Varredura

  1. As amostras para MEV devem ser preparadas no dia da imagem. Coloque uma tira de fita de carbono dupla face em um stub SEM. Um marcador permanente pode ser usado para rotular a parte metálica do toco para referência posterior.
  2. Use uma espátula de metal para coletar uma pequena quantidade de nanopartículas liofilizadas e espalhe-as suavemente pela superfície da fita. Escove a superfície do toco com um lenço de laboratório ou use ar comprimido para remover nanopartículas soltas.
  3. Cubra a amostra com paladium dourado por 30-120 segundos. Um tempo de pulverização mais longo produzirá uma superfície mais lisa para a geração de imagens, embora isso possa resultar na perda de detalhes finos da superfície.
  4. Os parâmetros típicos para visualização de partículas são uma distância de trabalho de 5 a 15 mm, intensidade do feixe de 5 a 12 kV e um tamanho de ponto de 1 a 3. Intensidades de feixe mais altas podem resultar em aquecimento regional da amostra, o que alterará a morfologia da superfície das partículas. As micropartículas são observadas com ampliação de 100X e as nanopartículas serão distinguíveis com ampliação de 3.000X.
  5. A amostra ideal consistirá em um revestimento uniforme de partículas na superfície plana do toco. Ocasionalmente, estruturas secundárias (incluindo flocos ou esferas) podem resultar da liofilização. Focar na borda de um floco, onde o floco encontra a fita, ou no topo de uma esfera ajudará a localizar partículas que podem ser facilmente visualizadas com SEM. Colete pelo menos três imagens por lote para obter uma amostra representativa do tamanho e morfologia das partículas.

Resultados

Imagens representativas de micro e nanopartículas de PLGA obtidas com este protocolo são mostradas nas Figuras 2a e 2b. As partículas aparecerão como esferas individuais, não fundidas, com morfologia de superfície lisa e uma ampla faixa de tamanhos distribuída por toda a amostra.

Para determinar o diâmetro médio de cada lote, são realizadas medições diretamente nas imagens de MEV utilizando a função "medir" do ImageJ. Deve-se realizar um mínimo de 150 medições do diâmetro de partículas selecionadas aleatoriamente no campo de visão para obter uma distribuição de tamanho representativa. O tamanho médio de um lote de partículas depende dos parâmetros da formulação. Por exemplo, na Figura 2a, micropartículas (diâmetro médio de 730 nm±370) foram formadas com 1 ml de solvente para 100 mg de PLGA, utilizando 0,05% de Vitamin E-TPGS na fase emulsificante, enquanto na Figura 2b, nanopartículas (diâmetro médio de 340 nm±70) foram formadas com 4 ml de solvente para 200 mg de PLGA, encapsulando o fármaco hidrofóbico camptotecina e utilizando 0,3% de Vitamin E-TPGS na fase emulsificante (os parâmetros completos da formulação estão descritos na legenda da figura). De modo geral, uma concentração mais elevada de emulsificante produz partículas menores, sendo possível obter diâmetros médios na faixa de 220 a 2.000 nm ao variar a concentração do emulsificante de 0,3 a 0,01% (Figura 3).

Nossos rendimentos variam de 74-98% (22 lotes de nanopartículas com diferentes solventes, emulsificantes e condições de emulsificação, preparados por um único pesquisador). Rendimentos melhores podem ser observados em lotes maiores (>150 nm), já que nanopartículas pequenas são facilmente perdidas durante a centrifugação e a etapa de lavagem, especialmente quando o sobrenadante de lavagem é decantado do pellet. Uma pipetagem cuidadosa do líquido pode ajudar a evitar esse problema. Velocidades mais altas e/ou tempos mais longos de centrifugação também podem melhorar o rendimento, tanto pela melhor coleta da fração ultrafina de nanopartículas quanto pela compactação do pellet, de modo que menos material seja perdido na etapa de lavagem. O protocolo descrito aqui concentra-se na produção de partículas utilizando TPGS como agente emulsificante e EtAc como solvente; entretanto, são possíveis solventes e/ou agentes emulsificantes alternativos. Em geral, observamos que o EtAc produz nanopartículas menores e mais uniformes em tamanho do que o DCM (ex. diâmetros de 540 nm±190 versus 2.160 nm±1.530 para EtAc versus DCM, 100 mg/ml de PLGA no solvente, emulsificado em 2 ml de TPGS 0,1%), presumivelmente porque o EtAc é miscível em água, ao passo que o DCM não é. O PVA é um agente emulsificante amplamente utilizado, empregado extensivamente por nosso grupo e outros. Observamos variabilidade nas nanopartículas preparadas a partir de diferentes lotes de PVA comercialmente disponível. É aconselhável, portanto, utilizar o mesmo estoque de PVA sempre que possível, a fim de melhorar a reprodutibilidade. Em nossa experiência, o PVA atua como emulsificante mais eficaz em concentrações muito mais altas do que o TPGS (ex. diâmetro de 140 nm±48, 100 mg/ml de PLGA em DCM, emulsificado em 2 ml de PVA 5%).

Caracterizar nanopartículas com MEV pode ser desafiador devido às diferenças em equipamentos e no processo de imageamento. É, portanto, importante distinguir características morfológicas que indiquem problemas na formação das partículas de artefatos que são introduzidos inadvertidamente durante o imageamento. A fusão (Figuras 4a e 4b), a formação de covas (Figura 4c) ou rachaduras (Figura 4f) das partículas é ocasionalmente observada nas imagens de MEV. Esses artefatos às vezes indicam partículas mal formadas (por exemplo, na Figura 4a, a concentração do emulsificante era muito alta para formar partículas discretas), mas também podem resultar de artefatos introduzidos pelo método de caracterização (por exemplo, na Figura 4b, a amostra aqueceu durante o revestimento por pulverização catódica, e na Figura 4c, o aquecimento local provocado pelo feixe do MEV alterou a morfologia da superfície das partículas durante o imageamento). Para evitar artefatos de imageamento, o tempo de pulverização catódica deve ser minimizado e a potência do feixe mantida baixa. Morfologias mais suaves são observadas com tempos mais longos de pulverização catódica; no entanto, isso pode induzir a fusão das partículas. Tempos de pulverização muito curtos podem dificultar o imageamento, pois as partículas ficarão carregadas e se moverão durante a captura da imagem. Capturar imagens rapidamente ajudará a evitar exposição prolongada ao feixe e distorção das imagens (Figuras 4d e 4e). Exposições elevadas ao feixe também podem resultar em expansão e rachaduras na superfície da nanopartícula (Figura 4f). Se os artefatos morfológicos não puderem ser minimizados pela alteração dos parâmetros de caracterização, é possível que representem problemas reais nas próprias nanopartículas. Durante o processo de fabricação, a fusão pode resultar de superaquecimento devido à alta potência de ultrassonicação, evaporação incompleta do solvente, ressuspendimento incompleto durante a fase de lavagem ou liofilização mal sucedida.

Processo de separação de óleo e água; sonicação, evaporação, coleta; diagrama de liofilização.
Figura 1. Esquema da fabricação de nanopartículas. Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Estrutura de nanopartículas (MEV) e distribuição de tamanho (μm, nm), gráfico de análise comparativa.
Figura 2. Imagens de MEV e distribuições de tamanho correspondentes de micropartículas e nanopartículas de PLGA produzidas pelo método de emulsão simples. Em (A), as partículas foram formadas emulsionando 100 mg de PLGA dissolvidos em 1 ml de acetato de etila em 2 ml de Vitamina E-TPGS 0,05%, e endurecidas em 45 ml de Vitamina E-TPGS 0,01%. A distribuição de tamanho correspondente é mostrada em (C). Em (B), as partículas foram formadas emulsionando 200 mg de PLGA e 40 mg de camptotecina dissolvidos em 4 ml de acetato de etila em 4 ml de Vitamina E-TPGS 0,3%, e endurecidas em 90 ml de Vitamina E-TPGS 0,3%. A distribuição de tamanho correspondente é mostrada em (D). Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Análise de tamanho de partículas; gráfico de barras e imagens de MEV mostram o efeito da porcentagem de TPGS no tamanho das microesferas.
Figura 3. O tamanho das partículas depende da concentração do emulsificante. O aumento da concentração de Vitamina E-TPGS resultou em nanopartículas menores. São apresentados os diâmetros médios e as imagens correspondentes de MEV de partículas preparadas por emulsificação de 100 mg de PLGA dissolvido em 1 ml de acetato de etila em soluções contendo (A) 0,01%, (B) 0,05%, (C) 0,1% ou (D) 0,3% de Vitamina E-TPGS e posterior endurecimento em 45 ml de solução 0,3% de Vitamina E-TPGS. As barras de erro representam o desvio padrão de 200 medições de diâmetro realizadas em 2 imagens de um único lote. A escala representa 5 μm (A-C) e 200 nm (D).Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Micrografia de MEV mostrando a morfologia das partículas e agregação. Análise da microestrutura do pó.
Figura 4. Artefatos da morfologia da superfície observados por MEV. Em (A), houve fusão acentuada e estruturas semelhantes a lâminas presentes em toda a amostra. A concentração de Vitamina E-TPGS era excessiva (1%) para formar partículas discretas. Em (B), algumas regiões da amostra estavam fundidas, contudo, grandes bolsões de nanopartículas discretas existiam, particularmente onde havia falhas na camada de pulverização. Acreditamos que esses artefatos de fusão sejam decorrentes do aquecimento durante o processo de pulverização. Em (C), as partículas inicialmente pareciam lisas, contudo, a exposição prolongada da amostra ao feixe de MEV resultou em formação de covinhas e enrugamento. (D) mostra uma imagem de baixa resolução obtida com exposição mínima da amostra ao feixe de MEV; as partículas parecem lisas com morfologia arredondada. Em (E), a mesma amostra é exposta por um período mais longo, e observa-se distorção evidente de sua morfologia original. Em (F), uma exposição prolongada ao feixe com alta tensão (12 kV) provocou aquecimento e fissuração das partículas. Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Discussão

As partículas de PLGA são comumente preparadas por emulsão simples ou dupla, um método que fornece a capacidade de personalizar as características das partículas, como tamanho, encapsulante e propriedades de superfície7. Essas propriedades e outras dependem de muitas variáveis, incluindo tipo de solvente, proporções de alimentação, método de emulsificação e tipo de emulsificante. No entanto, em nossa experiência, é possível que um único experimentador produza partículas com propriedades consistentes. Usando o mesmo protocolo, um experimentador bem treinado produziu sete lotes separados de nanopartículas com os seguintes diâmetros médios: 317 nm±99, 342 nm±112, 298 nm±104, 361 nm±110, 339 nm±115, 360 nm±123 e 364 nm±110. A média dos lotes do experimentador bem treinado produz um diâmetro médio de 340 nm±25 e um desvio padrão médio dentro do lote de 110 nm±8. Um segundo experimentador, treinado pelo primeiro, usou o mesmo protocolo para produzir nanopartículas com diâmetro médio de 328 nm±138. No entanto, um terceiro experimentador, que vinha fabricando nanopartículas de forma independente há vários meses, seguiu o mesmo protocolo para produzir nanopartículas com um diâmetro médio de 220 nm±70. Assim, é possível fazer partículas com uma faixa esperada de diâmetros, mas isso depende da replicação exata da técnica experimental sutil. O agrupamento de lotes pode permitir a produção de grandes quantidades de nanopartículas com propriedades agregadas idênticas. Por exemplo, quando modificamos a superfície de nanopartículas para estudo in vitro ou in vivo , vários (até 6) lotes de 200 mg são preparados, lavados, coletados, misturados em um único tubo e, em seguida, divididos para modificação de superfície. Isso garante que o tamanho da nanopartícula, a carga do medicamento, a carga e a fração dos locais de superfície disponíveis para modificação sejam comparáveis entre dois grupos de tratamento. Em outro exemplo, se a variável de interesse é a eficácia do medicamento com diferentes agentes sendo carregados em diferentes lotes de nanopartículas, é importante medir e controlar a variabilidade na carga do medicamento. É fundamental que as propriedades das partículas sejam medidas para cada lote de partículas produzidas e que os experimentos sejam projetados e replicados para controlar a variabilidade de lote para lote.

A emulsão completa das fases orgânica e aquosa é fundamental para a formação de pequenas partículas. O poli (álcool vinílico) (PVA) é talvez o emulsificante mais comumente usado. Nós e outros usamos uma variedade de agentes emulsificantes e estabilizantes, incluindo vitamina E-TPGS9, PVA14, spans15 e poloxâmeros16 (para uma discussão completa da ampla gama de agentes usados para a produção de partículas de PLGA, consulte a revisão de Wischke et al.17). O polímero devidamente emulsionado aparecerá como uma solução homogênea, branca leitosa/opaca. Uma emulsão pobre (ou "quebrada") mostrará heterogeneidade ou granularidade macroscópica e pode até se separar em duas camadas visualmente distintas no tubo. Isso geralmente indica uma falha na formação de nanopartículas. A emulsão pode quebrar seguindo a etapa 1.9 se não for imediatamente transferida para o ultrassom. Se isso ocorrer, vórtice novamente até ficar homogêneo e prossiga imediatamente para o sonicador. A separação não deve ocorrer após a etapa de sonicação (1.10). Uma vez que as partículas tenham sido dispersas em um volume aquoso maior (etapa 1.11), a solução deve ser uniformemente opaca a ligeiramente translúcida. A qualidade translúcida aumentará à medida que o tamanho das partículas diminui, e uma tonalidade azul pode ser observada para nanopartículas muito pequenas. Essa tonalidade pode não ser observada se as partículas encapsularem um medicamento. Se a emulsão não se dispersar uniformemente no grande volume aquoso ou parecer granular, o experimento não deve prosseguir. É normal observar alguma variação na aparência do pellet de partículas, bem como em sua coesão. Alguns pellets podem ressuspender após vórtice leve, enquanto outros podem levar vários minutos de sonicação em banho-maria. A ressuspensão não deve demorar mais de 5 minutos. As partículas liofilizadas podem assumir uma variedade de texturas, desde o algodão até o fluxo livre.

Uma das muitas vantagens do PLGA como material de nanopartículas é a capacidade de otimizar o processo de fabricação para criar o tamanho desejado de partícula para a aplicação pretendida. Nanopartículas maiores encapsularão uma fração maior de fármaco hidrofóbico (em relação ao peso do polímero) do que nanopartículas pequenas, no entanto, a cinética de liberação do fármaco também pode ser afetada18-20. O tamanho das nanopartículas tem um efeito direto nos mecanismos de internalização de partículas pelas células, bem como sua distribuição no tecido, o que pode resultar em diferenças dramáticas na eficácia da entrega. Por exemplo, o sistema de fagócitos mononucleares marcará e removerá agentes na circulação sistêmica maiores que 1 μm. Pequenas nanopartículas podem ser de interesse para infusão direta no cérebro, onde nanopartículas maiores ficariam presas na matriz extracelular apertada; A entrega de pequenas nanopartículas também pode facilitar o direcionamento passivo de tumores por meio do efeito aprimorado de permeação e retenção. A eficiência de encapsulamento do medicamento varia amplamente, dependendo das propriedades do medicamento específico, do tamanho da partícula e do emulsificante (ou seja, sua solubilidade em água versus solvente). A emulsão simples versus dupla também afetará o carregamento do medicamento e o tamanho das nanopartículas. O encapsulamento de agentes hidrofóbicos via emulsão única pode auxiliar na produção de nanopartículas ultrapequenas, em comparação com o método de emulsão dupla. Direcionamos o leitor para outros recursos para uma discussão extensa deste tópico23-28. Por fim, métodos alternativos de emulsificação estão disponíveis, incluindo homogeneização de alta velocidade, e essas outras abordagens podem fornecer vantagens para tipos específicos de medicamentos ou aplicações de administração de medicamentos29.

O método de emulsão única apresenta uma oportunidade de variação de uma ampla gama de variáveis de formulação, cada uma das quais é capaz de alterar as propriedades das nanopartículas. Por exemplo, o uso de diclorometano (DCM) como solvente geralmente produzirá nanopartículas maiores com uma distribuição de tamanho mais ampla. Como o acetato de etila (EtAc) é miscível em água, a tensão superficial da gota de polímero na emulsão primária é diminuída, produzindo nanopartículas menores. O DCM pode ser substituído pelo mesmo volume de EtAc. Solventes alternativos ou misturas de solventes podem ser usados para otimizar o encapsulamento de medicamentos e as propriedades das partículas. Outros parâmetros de formulação também são capazes de alterar o tamanho das partículas: por exemplo, aumentar o volume do solvente, a proporção solvente:polímero, a intensidade da sonicação ou a velocidade/duração da centrifugação resultarão em uma diminuição no tamanho das partículas coletadas. É possível dimensionar partículas fracionadas realizando centrifugação sequencial (por exemplo, uma centrifugação rápida e de baixa velocidade para remover primeiro partículas maiores, seguida por uma centrifugação mais longa para coletar partículas ultrapequenas) ou filtragem.

Aqui, descrevemos parâmetros de formulação que permitem a preparação de partículas de PLGA com diâmetros médios variando de 220 nm a 1,98 μm. Esses métodos para a produção de partículas compostas de PLGA podem ser usados para otimizar o design de partículas (tamanho, encapsulante e propriedades de superfície) para futuras aplicações de entrega de medicamentos in vitro ou in vivo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores não têm agradecimentos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido poli(lático-co-glicólico)   (PLGA)figure-materials-1 LactelB6010-2PViscosidade inerente: 0,55-0,75 dl/g
Acetato de etila (EtAc)Sigma270989
Cloreto de metileno (DCM)
TPGS de vitamina ESigma57668
Álcool polivinílico87-89% hidrolisado, 30.000-70.000 Da
Equipamento
Dismembrador sônicoFisher ScientificModelo 705700 W (ultrassonicator)
Ponta do ultrassomFisher Scientific1/8 pol.
VortexVWR58816-121
Agitador multiposiçãoCorningMP5I
UltracentrífugaBeckman-CoulterL8-80M
Rotor de ângulo fixoBeckman-Coulter50.2TI
Banho ultrassônicoFisher ScientificFS30
LiofilizadorMillrockBT85

Referências

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