Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

Resumo

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Resumo

Trabalhar com tecidos delicados pode ser um fator complicador na avaliação imuno-histoquímica. Aqui, apresentamos um método que utiliza uma membrana de PTFE hidrofilizada suportada em anel para fornecer suporte estrutural ao tecido vivo e fixo durante o processamento imuno-histoquímico, o que permite o uso de uma variedade de protocolos que, de outra forma, causariam danos ao tecido. Primeiro, isso é demonstrado com o carregamento em bolus de marcadores fluorescentes no tecido retiniano vivo. Este método permite a visualização rápida de estruturas direcionadas, enquanto o suporte da membrana mantém a integridade do tecido durante a injeção e permite a fácil transferência da preparação para imagens ou processamento posteriores.

Em segundo lugar, é descrito um procedimento para coloração de anticorpos em tecido fixado com carbodiimida. Embora a fixação de paraformaldeído seja mais comum, a fixação de carbodiimida fornece um substrato superior para a visualização de proteínas sinápticas. Uma limitação da carbodiimida é que o tecido fixo resultante é relativamente frágil; no entanto, isso é superado com o uso da membrana de suporte. O tecido da retina é usado para demonstrar essas técnicas, mas elas podem ser aplicadas a qualquer tecido frágil.

Introdução

A realização de imuno-histoquímica em tecidos delicados e intactos corre o risco de danos durante o manuseio e a transferência. Isso pode ocorrer em fatias do cérebro ou em outros tecidos finos, como retina degenerada. Além disso, existem certos métodos de fixação tecidual que podem ser vantajosos para a imunomarcação de estruturas neuronais, mas resultam em estabilidade estrutural comprometida, impedindo seu uso. Um exemplo particular disso é a fixação à base de carbodiimida, que é superior para a coloração de receptores e hormônios^1-7, mas é comumente evitada devido à instabilidade do tecido fixado.

Aqui, descrevemos um procedimento que utiliza uma membrana de PTFE hidrofilizada para suportar estruturalmente tecidos delicados, fixos ou não fixos, para uma variedade de técnicas de coloração. A membrana de suporte permite a manipulação de tecidos delicados antes e depois da fixação, permitindo várias etapas de processamento, minimizando o risco de danos aos tecidos. No geral, esse método simples para preservar a integridade do tecido oferece a oportunidade de usar técnicas que, de outra forma, poderiam ser evitadas. Como tal, essa abordagem também pode ser usada com sucesso para a preparação de uma ampla variedade de tecidos, como fatias de cérebro, que se tornam frágeis após procedimentos de corte.

Protocolo

Em todos os procedimentos experimentais, os animais foram tratados de acordo com os regulamentos da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visual e em conformidade com os protocolos aprovados pelo Weill Cornell Medical College. Os animais foram eutanasiados por dióxido de carbono e subsequente luxação cervical.

1. Dissecção da retina de montagem total

1. Depois que o camundongo for sacrificado, enuclee seus olhos e coloque-os em solução de Ringer oxigenada com tamponamento HEPES (Tabela 1).
2. Remova a córnea cortando em um caminho circular ao longo da ora serrata com uma tesoura pequena, segurando o olho no limbo com uma pinça. Puxe a lente com uma pinça.
3. Remova o máximo de vítreo possível, usando uma pinça de borda embotada. Esta etapa é importante para injeções em bolus e registros eletrofisiológicos; não é necessário para quando se realiza apenas imuno-histoquímica.
4. Separe a retina da ocular posicionando uma pinça entre a retina e a ocular, movendo a pinça lentamente ao redor da circunferência. Estabilize a ocular segurando a esclera firmemente com um segundo conjunto de pinças. Corte o nervo óptico no local entre a retina e a ocular para facilitar a separação da retina da ocular.
5. A retina pode ser dissecada em pedaços (por exemplo, quartos) ou usada como um todo. Para cortar em pedaços, use uma tesoura para fazer incisões da periferia da retina até o nervo óptico. Alternativamente, para usar toda a retina, faça incisões da periferia até a metade do nervo óptico. As incisões ajudarão a fazer uma preparação plana.

2. Montagem em inserção de membrana de PTFE hidrofilizado

1. Prepare a membrana conforme descrito abaixo. Quando forem realizados registros fisiológicos ou experimentos de injeção de corante, encurte o suporte usando um torno ou um serrote para que o anel restante tenha uma altura de 1 mm.
   Nota: Os insertos da placa de cultura podem não ser modificados ou modificados (Figura 1A). A escolha da configuração é ditada pelo objetivo do experimento. Para imunocoloração, uma inserção não modificada é adequada.
2. Polir superfícies ásperas com lixa fina (grão 300 ou superior).
3. (Opcional) Remova os pés embaixo do anel com uma tesoura.
4. Para remover quaisquer detritos, enxágue ou sonice a membrana em água destilada por 2-3 min.
5. Monte o tecido na membrana (Figura 1A). Coloque o tecido com alguma solução em cima da membrana com uma pipeta de transferência de plástico. Corte a ponta estreita da pipeta, se necessário, para evitar que a amostra de tecido adira à pipeta durante a transferência.
6. Prenda a retina com células ganglionares (GCs) para cima: na membrana, remova gradualmente a solução enquanto espalha a retina e desdobra as dobras com uma pinça.
7. No lado oposto da membrana, posicione uma seringa vazia (1 ml) diretamente abaixo do tecido. Aplique a sucção puxando o êmbolo para trás até um volume de 0,2-0,3 ml. Aumente a área de superfície de sucção cortando a ponta de retenção da seringa antes de usar. O tecido não requer tratamento adicional para adesão, pois está fisicamente enredado dentro da membrana.

3. Injeção em bolus de isolectina Alexa 488

1. Prepare pipetas de adesivo e solução de coloração. Puxe pipetas de vidro capilar de borossilicato com um extrator Flaming/Brown, com uma resistência de ~1 MΩ. Quebre suavemente a ponta da pipeta.
2. Faça a solução de coloração adicionando 0,3 μl de solução estoque de isolectina Alexa 488 a 10 μl da solução de Ringer tamponada com HEPES descrita na etapa 1.2.
3. Transfira a amostra para a configuração patch-clamp para injeção (Figura 1C). Colocar a membrana com o tecido ligado na câmara de registo perfundida com solução de Ringer tamponada com HEPES aquecida (37 °C) e oxigenada.
4. Coloque a pipeta contendo corante contra a membrana limitante interna (ILM, Figura 2A). Usando o micromanipulador, avance ainda mais a pipeta contra o ILM até que ela penetre nele. Injete a solução de coloração com uma pressão de 10-20 psi por 1 segundo usando um picospritzer. Um ou vários locais podem ser alvo de injeção (Figura 2B). Se não estiver disponível um picospritzer, pode ser utilizada uma seringa de 10 ml para fornecer uma pressão de ar positiva para injeção.
5. Incubar o tecido injetado por 10 min. Durante a incubação, o tecido injetado pode ser visualizado sob iluminação de epifluorescência.
6. Após a rotulagem, a preparação pode ser levada a um microscópio para geração de imagens. Transfira o inserto para uma placa de cultura com fundo de vidro, colocando o lado da retina voltado para baixo (Figura 1C).
7. Adicione uma gota de solução HEPES para manter a amostra úmida.
8. Coloque 2-3 pontos de graxa a vácuo ao redor do perímetro do anel de plástico para prender firmemente o inserto no fundo da placa de cultura.
9. Transfira o prato para o microscópio stage.

4. Fixação de Paraformaldeído e Carbodiimida

1. Fixe a amostra transferindo o inserto para o fixador por 15 min. Tempos de fixação mais longos ou mais curtos podem ser usados, dependendo da aplicação. Ambos os fixadores podem ser efetivamente usados para fixar GFP, isolectina ou hidrazidas fluorescentes Alexa (por exemplo, usadas para preencher as células em gravações de patch-clamp).
   Nota: Para fixação, podem ser utilizadas soluções de carbodiimida a 4% ou paraformaldeído a 4%. Para manter a aderência, a fixação deve ser feita após o tecido já ter sido fixado à membrana. O tecido pode ser fixado imediatamente após a montagem ou após registro fisiológico e/ou injeção em bolus.
2. Enxágue o tecido em tampão fosfato (PB) por 30 min. Depois disso, o tecido pode ser processado como um todo (etapa 5) ou cortado em seções verticais e depois processado (etapas 6 e 7).

5. Imunocoloração de Wholemounts Retinianos

1. Em uma placa de 24 poços (Figura 1D), bloqueie os pedaços da retina na membrana por 1 hora em uma solução de coloração.
2. Dilua os anticorpos primários anti-PSD-95 de camundongo 1:300 na solução de coloração e aplique por 48 horas em temperatura ambiente no escuro. Adicione ~ 100-150 μl de solução de anticorpo em cada poço com o tecido. Para evitar o ressecamento, encha os poços não utilizados com água destilada.
3. Enxágue por 20 min em PB, 3x.
4. Incubar por 24 horas em anticorpo secundário Alexa 568 anti-camundongo de burro dissolvido 1:500 na solução de coloração.
5. Enxágue por 20 min em PB, 3x.
6. Coloque o inserto com o tecido corado em uma placa de Petri padrão de 3 cm cheia de solução de PB. Com uma tesoura pequena, corte a parte da membrana que contém a retina do anel.
7. Transfira a retina na membrana para uma retina deslizante para cima. Remova o PB, adicione o meio de montagem. Coloque pequenos pedaços de um vidro de lamínula quebrado entre a lâmina e os copos de lamínula para evitar apertos extensos e danos à retina. Coloque a lamínula.
8. Sele a lamínula no lugar com esmalte. Mantenha os slides no escuro, na geladeira.

6. Seccionamento vertical de tecido montado em membrana

1. Após a fixação, mergulhe o tecido na membrana nas soluções de gradiente de sacarose de sacarose a 10%, 20% e 30% de sacarose por 30 min, 1 hora e durante a noite, respectivamente. A etapa noturna é realizada a 4 ° C na geladeira, todas as outras etapas à temperatura ambiente.
2. Usando uma tesoura, remova a membrana com o tecido do anel de inserção de plástico.
3. Coloque a membrana cortada no Parafilm com a retina para cima e remova o máximo de solução possível com Kimwipes.
4. Colocar o parafilme com o tecido na câmara do criostato e adicionar uma gota de OCT Use o dispositivo de freezer rápido para acelerar o congelamento.
5. Retire a amostra congelada e vire-a.
6. Cortar o excesso de OCT congelado. Deixar cerca de 2 mm à volta da amostra em três lados e deixar a 5-6 mm do lado que será fixado ao suporte.
7. Cubra o lado da retina exposto (lado da membrana) com uma gota de OCT. Deixe a área de fixação livre.
8. Congele a membrana com tecido retiniano. Agora a amostra está pronta para ser colocada em um suporte de corte.
9. Coloque uma gota de OCT em um anel porta-moedas frio. Insira imediatamente a amostra congelada na gota.
10. Corte seções de 10-20 μm de espessura, ajustando a temperatura do criostato em -19 °C. Use lâminas de adesão de polisina quentes (temperatura ambiente). Deixe as lâminas com as seções anexadas em uma plataforma de aquecimento por ~ 2-3 min (41 ° C) no escuro para garantir a adesão firme das seções.
11. Coloque as lâminas em uma caixa de armazenamento e mantenha a -20 °C até o uso.

7. Imunocoloração de Seções da Retina

1. Retire as lâminas com as seções do freezer. Deixe-os ficar em temperatura ambiente por 1 min para remover o condensado.
2. Circunde as seções com um bloqueador de líquido para criar uma barreira para incubação posterior.
3. Coloque as lâminas na caixa de incubação. Cubra o fundo da caixa com água para evitar a evaporação da solução de anticorpos.
4. Enxágüe com PB por 5 min.
5. Prepare as mesmas soluções de coloração e siga as etapas da etapa 5. A incubação com o anticorpo primário é durante a noite e com o secundário 1 hora. Não use vidro quebrado entre a lamínula e a lâmina.

Resultados

Demonstrados aqui estão dois experimentos representativos que se beneficiam do uso de uma membrana de PTFE hidrofilizada para apoiar a retina de montagem total durante os procedimentos de coloração. O primeiro experimento ilustra o método para caracterização rápida e simples da vasculatura da retina, uma elaborada rede de vasos sanguíneos que se estendem por várias camadas da retina (Figura 2). Essa abordagem combina o carregamento em bolus de isolectina com marcação por imersão com SRH. Este é um método...

Discussão

A alta biocompatibilidade e transparência da membrana de PTFE hidrofilizada nas soluções é vantajosa ao trabalhar com tecidos vivos. Esta preparação foi usada com sucesso em trabalhos anteriores para gravações de patch-clamp de respostas à luz^8-10. Aqui, mostramos como essa abordagem pode ser adotada para análise estrutural da retina de montagem total.

A técnica de carregamento de bolus pode ser usada com eficácia para rotular tecidos vivos. Esta técnica é auxiliada pelo suporte est...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Inserto de Cultura de Células Millicell, 12 mm, PTFE hidrofílico (Biopore), 0.4 μ m	Seringa	de insulina Millipore PICM01250
, tesoura	de 309659		Beckton Dickinson
Fine Science Tools	15003-08		de dissecação
, Dumont # 55, inox	Fine Science Tools	11255-20	dissecção
Cryostat	Leica	vários
sistema de microscópio confocal	Nikon	vários
instrumentos de vidro capilar	1B150F-4
P-97 da	Sutter de Flaming
Picospritzer III	Parker Hannifin
	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
de Petri	Falcon	1008
Pipetas de transferência graduada descartáveis	VWR	16001-180
Placas multipoços, 351147
Beckton Dickinson de 24 poçosVidro de cobertura, # 1	Electron Microscopy Sciences	72200-30
Lâminas de adesão de polisina	Electron Microscopy Sciences	63412-01
Lâminas de microscópio	Globe	1301
Liquid Blocker	Electron Microscopy Sciences	71312
Meio de montagem VECTASHIELD	Vector Laboratories	H-1000
OCT médio	Sakura	4583
Filme de laboratório Parafilm	Fisher	13-374-10
Graxa de alto vácuo Dow Corning	Sigma-Aldrich	Z273554
Mouse anti-PSD95	Millipore	MABN68	anticorpo
Burro anti-mouse Alexa 568	Invitrogen	A10037	anticorpo
Isolectina Alexa 488	Invitrogen	I21411
Chemiblocker	Chemicon	2170S
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Sulforhodamine	Sigma-Aldrich	341738
Carbodiimida	Thermo Scientific	22980
EDC Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148