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Isolamento e caracterização de proteínas quimricas que expressam fc humanos usando adsorbers de membrana de proteína e um fluxo de trabalho simplificado

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DOI:

10.3791/51023

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8 de janeiro de 2014

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1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Ohio University, 2Biomedical Engineering Program, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, 3Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

Neste artigo

Resumo

Em comparação com a cromatografia de afinidade tradicional usando colunas repletas de proteínas Agarose, os adsorbers de membrana A da proteína A podem acelerar significativamente o isolamento em escala laboratorial de anticorpos e outras proteínas que expressam fragmentos de Fc. Os métodos adequados de análise e quantificação podem acelerar ainda mais o processamento de proteínas, permitindo que o isolamento/caracterização seja concluído em um dia útil, em vez de mais de 20 horas de trabalho.

Resumo

A escala laboratorial para a purificação em escala industrial de biomoléculas de supernacantes de cultura celular e soluções celulares límedas pode ser realizada usando cromatografia de afinidade. Enquanto a cromatografia de afinidade usando proteína porosa As contas de agarose embaladas em colunas é sem dúvida o método mais comum de isolamento em escala laboratorial de anticorpos e proteínas recombinantes expressando fragmentos de Fc de IgG, pode ser um processo demorado e caro. As restrições de tempo e financeiros são especialmente assustadoras em pequenos laboratórios básicos de ciência que devem recuperar centenas de microgramas para quantidades miligramas de proteína de soluções diluídas, mas não têm acesso a sistemas de entrega de líquidos de alta pressão e/ou pessoal com experiência em bioseparações. Além disso, a quantificação e caracterização do produto também podem alongar excessivamente o tempo de processamento ao longo de vários dias úteis e inflar despesas (consumíveis, salários, etc.). Portanto, um protocolo rápido, barato, mas eficaz é necessário para o isolamento em escala laboratorial e caracterização de anticorpos e outras proteínas que possuam um fragmento de Fc. Para isso, elaboramos um protocolo que pode ser preenchido por equipe técnica de experiência limitada em menos de 9 horas (aproximadamente um dia útil) e tão rapidamente quanto 4 horas, em oposição aos métodos tradicionais que exigem mais de 20 horas de trabalho. A maioria dos equipamentos necessários está prontamente disponível em laboratórios de ciência biomédica padrão, bioquímica e (bio)engenharia química, e todos os reagentes estão disponíveis comercialmente. Para demonstrar este protocolo, são apresentados resultados representativos nos quais a galepina quimrica murina-1 fundida ao DFc humano (Gal-1hFc) da cultura celular foi isolada usando um adsorber de membrana A da proteína A. Gal-1hFc purificado foi quantificado por meio de um procedimento acelerado de análise de manchas ocidentais e caracterizado por citometria de fluxo. O fluxo de trabalho simplificado pode ser modificado para outras proteínas que expressam Fc, como anticorpos, e/ou alteradas para incorporar métodos alternativos de quantificação e caracterização.

Introdução

Isolamento de anticorpos e proteínas recombinantes expressando imunoglobulina G (IgG) Fragmentos de fc de supernantes da cultura celular e soluções celulares diluídas podem ser realizados usando cromatografia de afinidade da proteína A. Em laboratórios básicos de ciência e engenharia e indústria, colunas repletas de proteína porosa A-coated agarose, vidro ou contas poliméricas são mais comumente usadas para cromatografia de afinidade, apesar dos altos custos financeiros e dos longos tempos de processamento1-3. É bem apreciado que a cromatografia de afinidade representa o maior gargalo de gastos e processamento em ambientes laboratoriais e industriais2,4. Como resultado, inúmeras melhorias foram desenvolvidas para diminuir o custo e o tempo de processamento sem sacrificar a recuperação geral do produto do trem de processo1,2,5-7. Particularmente promissor para o isolamento de anticorpos e outras proteínas que expressam Fc é a cromatografia de afinidade usando uma proteína A de adsorber de membrana2,5,7-10. Considerando que a captura de Fc na cromatografia da coluna é limitada à difusão (ou seja, a proteína que expressa fc deve difundir dentro e através de poros internos para atingir a maioria da proteína A) com queda de alta pressão através da coluna, o transporte de massa em adsorbers de membrana é impulsionado por convecção a granel, resultando em evitar limitações de difusão8,9,11,12. Além disso, a queda de pressão no adsorber da membrana é baixa, permitindo assim taxas de fluxo de perfusão mais rápidas em comparação com as colunas embaladas por contas8,9,11,12. Assim, para o isolamento em escala laboratorial, prevê-se que a cromatografia da membrana reduza o tempo de isolamento em várias horas e aumente a captura do produto em comparação com a cromatografia da coluna. Além disso, foram propostos modelos matemáticos para adsorção de IgG em adsorbers de membrana8,9,11,12, permitindo assim que os usuários finais prevejam o desempenho em laboratório.

Outro gargalo nos laboratórios básicos de ciência e engenharia é a caracterização da proteína de expressão de Fc. No entanto, a seleção de métodos apropriados para completar ensaios de caracterização, tais manchas ocidentais, pode reduzir muito o tempo gasto em testes de produtos. Por exemplo, a transferência semidária em um sistema tampão descontínuo pode realizar a transferência eletroforética de proteínas de um gel SDS-PAGE para uma membrana de difluoredina polivinina (PVDF) em questão de minutos, em vez de 1-2 horas de transferência de tanque (molhado) em um sistema tampão contínuo13.

Um protocolo rápido, barato e eficaz para isolar e caracterizar uma proteína de fusão quimrica expressando um fragmento fc de IgG humano é descrito aqui. A maioria dos equipamentos está prontamente disponível em laboratórios de ciência biomédica básica padrão, biologia, química e (bio)engenharia química, e todos os reagentes estão disponíveis comercialmente. Embora os resultados representativos tenham sido gerados a partir do isolamento e caracterização de uma proteína de fusão quimrica murina galectin-1/human Fc (Gal-1hFc), o protocolo simplificado pode ser aplicado ao isolamento de outras moléculas que possuem um fragmento de Fc, como anticorpos, fragmentos de Fc ou outras proteínas de fusão fc. Nossas melhorias diminuíram drasticamente o tempo de processamento (apenas 4 horas, mas mais tipicamente ~9 horas, em comparação com mais de 20 horas de trabalho) ao mesmo tempo em que alcançaram recuperação de produtos semelhantes ou melhoradas em comparação com os métodos padrão.

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Protocolo

1. Verifique a afinidade pela proteína A

  1. Verifique se a proteína de expressão de Fc (proteína de fusão recombinante ou anticorpo IgG, até então referido como "proteína") tem afinidade aceitável para a proteína A14-17 antes de usar a proteína A adsorber de membrana, e teste para a presença da proteína na solução de estoque ( porexemplo, cultura celular supernante clarificada por centrifugação a 1.000 x g por 5 min para pelotas células suspensas). Use citometria de fluxo, mancha ocidental, ELISA, etc. para detectar função proteica e/ou presença de Fc, com base na preferência do laboratório. Idealmente, quantifique a proteína na cultura celular supernascida (passo 6) para evitar exceder a capacidade de adsorber de membrana A. Proceda se a proteína for detectada.

2. Prepare proteína Um Adsorber de Membrana e Supernatante da Cultura Celular

  1. Siga as instruções do fabricante para preparar o adsorber de membrana. Nunca deixe o ar entrar no adsorber da membrana. Todas as soluções perfundidas através do adsorber de membrana devem estar em temperatura ambiente e pré-filtradas usando um filtro de 0,22 μm. Encha uma seringa de 10 ml com 0,22 μm filtrado de soro fisofado de Dulbecco (DPBS) ou tampão de opções e bolhas de ar de descarga. Perfuse DPBS para remover a solução de armazenamento e equilibrar o adsorber de membrana imediatamente antes do uso.
  2. Filtre a cultura celular sobrenatante imediatamente antes da perfusão através do adsorber de membrana, usando uma unidade de filtragem estéril de 0,22 μm acionada a vácuo.

3. Carregue a proteína A Membrana Adsorber

  1. Cultura celular aspirada sobrenatante em uma seringa Luer Lock (30 ml ou maior), e descarregar quaisquer bolhas de ar.
  2. Monte materiais e equipamentos como mostrado na Figura 1. Conecte a seringa à entrada do adsorber da membrana. Conecte tubos flexíveis à saída de adsorber de membrana. Se desejar, coloque um filtro de seringa de 0,22 μm entre a seringa e o adsorber de membrana. Use um frasco ou garrafa para pegar o fluxo (também conhecido como filtrado), a partir do adsorvo.
  3. Ajuste a bomba de seringa na taxa de fluxo volumoso desejada, mas não exceda a taxa de fluxo recomendada pelo fabricante (por exemplo, 10 ml/min). Perfunda a cultura celular supernacida através do adsorber de membrana, coletando fluxo através de um béquer ou outro recipiente. Recarregue a seringa com supernacantes necessários.
  4. Se desejar, teste o fluxo através da presença de proteínas usando citometria de fluxo, mancha ocidental, ELISA, etc. com base na preferência do laboratório. Normalmente é desnecessário reutilizar o fluxo.

4. Proteína elute do Adsorber de Membrana

  1. Lave o adsorvo de membrana com 10 ml DPBS para remover qualquer proteína não ligada.
  2. Proteína eluto do adsorber de membrana na taxa de fluxo desejada (por exemplo, 1 ml/min) usando 10-15 ml de tampão de elução(por exemplo, tampão de elução à base de amina (pH 2.8)). Capturar elunato em um tubo contendo tampão neutralizante (por exemplo, 1 M Tris (pH 9.4)) a 10% do volume de elução (1,0-1,5 ml).
  3. Alternativamente, a proteína eluto em um ml incrementa em tubos contendo 100 μl de tampão de neutralização, usando um volume total de 10-15 ml tampão de eluição. Use o método de caracterização preferido para testar cada fração para a presença de proteína.
  4. Regenerar o adsorber de membrana de acordo com as instruções do fabricante. Perfuse 10 ml de DPBS filtrado de 0,22 μm ou tampão de escolha, depois 10 ml de 0,22 μm filtrado 50 mM NaOH em 1 N NaCl, e finalmente 10 ml de DPBS filtrados de 0,22 μm. Encha o adsorber de membrana com 20% de etanol em DPBS para armazenamento a longo prazo a 4 ºC.

5. Concentre e digele a proteína

  1. Deposite todas as frações de elunato (ou frações de elução contendo proteínas conforme determinado na etapa 4.3) em uma unidade de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 10 kDa. Siga as instruções do fabricante para centrifugação.
  2. Dique o retentato em uma pequena unidade de diálise de volume (corte de peso molecular de 10 kDa) contra o tampão de escolha, seguindo as instruções do fabricante. O buffer pode precisar ser adicionado ao material dialisado se a precipitação de proteína for uma preocupação. Se desejar, o material dialisado pode ser refrigerado até que a etapa 6 possa ser realizada, mas o armazenamento a longo prazo sem conservantes não é recomendado.

6. Quantifique e caracterize o produto purificado em um procedimento de mancha ocidental acelerado

  1. Resolva as normas de proteína purificada e Fc no gel de escolha pela SDS-PAGE, sob condições de redução ou não de18-20. Use um mini gel em vez de gel midi para minimizar o tempo de execução.
    1. Se ainda não for conhecido, determine a faixa de padrões de Fc sobre qual sinal de banda varia linearmente em relação à quantidade de carga(por exemplo, 0,1-1 mgs). Use o mesmo gel, condições de funcionamento, condições de transferência e reagentes que serão usados para quantificar e caracterizar proteínas purificadas.
    2. Carregue várias quantidades amostrais de proteína purificada, incluindo amostras diluídas com DPBS, para garantir que os sinais de banda de proteína purificada estejam dentro da faixa de sinal linear dos padrões de Fc na análise de imagens.
  2. Transfira proteínas do gel para uma membrana de flúor de polivinilidene (PVDF) em um sistema tampão descontínuo usando uma mancha semidry13, seguindo as instruções do fabricante da mancha. O tempo de transferência é tipicamente de 5-10 min. Se desejar, Coomassie manche o gel após a transferência para verificar a eficiência da transferência21.
  3. Realize a imunoblotação com anti-Fc ou anti-IgG conjugado para fosfattase alcalina (AP) ou peroxidase de rabanete de cavalo (HRP), com base na preferência do laboratório, usando um sistema de detecção de proteína assistida a vácuo. O tempo de imunoblotting é tipicamente inferior a 1 hora.
  4. Desenvolver imunoblot usando o substrato e o método de escolha (por exemplo, substrato AP e chemiluminescence aprimorada).
  5. Quantifique a proteína purificada por análise de imagem. Realize uma regressão linear nos sinais de banda dos padrões fc. Se R2>0,90, use a equação para a linha para calcular a quantidade de proteína de seu sinal de banda(s). Conta para diluição amostral, se necessário. Uma vez que a quantificação da proteína é realizada com base em Fc, ajuste o valor para diferenças de peso molecular entre a proteína e Fc. Se R2<0,90, repita o passo 6 em sua totalidade.
  6. Validar a proteína usando ensaios funcionais ou métodos para detectar Fc via citometria de fluxo, mancha ocidental, ELISA, etc. com base na preferência do laboratório.
  7. Diluir a proteína à concentração desejada e/ou adicionar quaisquer conservantes ou estabilizadores desejados à solução de proteína purificada antes de aliquotar para armazenamento a longo prazo, congelado ou não.

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Resultados

O protocolo simplificado para isolamento e caracterização de proteínas que expressam Fc é rotineiramente usado para processar galectina-1 murina quimrica fundida ao Fc humano (Gal-1hFc) de supernantes de cultura celular diluída. O fluxograma na Figura 2 ilustra o fluxo de trabalho e o tempo para cada passo no protocolo. Para um lote típico de 300 ml de supernascimento, o tempo total de processamento é de aproximadamente 9 horas quando o teste opcional de citometria de fluxo de frações de elução é realiza...

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Discussão

O protocolo aqui descrito foi desenvolvido para isolar rapidamente e caracterizar uma proteína de fusão quimrica expressando Fc humano (Gal-1hFc), sem comprometer significativamente a recuperação do produto ou o custo inflacionário. Os principais componentes do fluxo de trabalho simplificado são um adsorber de membrana A para isolamento, e transferência semidária e imunoblotação assistida a vácuo para caracterização por manchas ocidentais.

A dramática diminuição do tempo de processamento para ...

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Divulgações

Não há nada para revelar.

Agradecimentos

Os autores desejam agradecer ao Sr. Luis F. Delgadillo (Departamento de Engenharia Química e Biomolecular da Universidade de Ohio), Ao Sr. Matthew H. Williams (Departamento de Engenharia Química e Biomolecular da Universidade de Ohio) e ao Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital e Harvard Medical School) pela assistência técnica especializada. Os autores também desejam agradecer aos alunos do Winter 2011 CHE 404/BME 504 e Outono 2012 CHE 4830/BME 5830 (Departamento de Engenharia Química e Biomolecular e Programa de Engenharia Biomédica da Universidade de Ohio) por aconselhamento técnico e discussão. Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (NSF) Major Research Instrumentation grant CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NCI grant 1R15CA16 1830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Pós-Doutorado F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) e NIH NCCAM grant R01AT004628 (CJD).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Adsorvente de membrana de proteína A (Sartobind Protein A 2 ml) Sartorius-Stedim93PRAP06HB-12--A
Filtro centrífugo Amicon Ultra, 10 kDa, 4 mlMilliporeUFC801008Use 15 ml de volume se necessário
Unidade de filtro a vácuo estéril, 0.22 µ m, 500 mlMilliporeSCGPU05RE
Seringas de 10 ml com pontas Luer LockBD301604
Seringas de 30 ml com pontas Luer LockBD309650
Tubo de laboratório Tygon (1/16 pol x 1/8 pol x 50 pés)Cole ParmerWU-95903-16
Dispositivos de diálise Slide-A-Lyzer MINI (10K MWCO)Thermo Scientific69576
Bandeja de coleta de anticorpos de identificação instantâneaEMD MilliporeWBAVDABTR
Suporte de borrão de poço único de identificação instantâneaEMD MilliporeWBAVDBH01
Tampão de eluiçãoThermo Scientific21004
Tris, ultra puroFisher Scientific819623
Cloreto de sódioFisher Scientific7647-14-5
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
DPBSThermo ScientificSH30028.02
DPBS com Ca2+/Mg2+Life Technologies14080-055
BSASigmaA9647
Human FcBethyl Research LaboratoriesP80-104
Anti-humano Fc-APCJackson Immunoresearch109136170
Anti-humano Fc-APBio-Rad170-5018
Substrato de fosfatase alcalinaPromegaS3841
Tubos de citometria de fluxo (5 ml de poliestireno ou polipropileno)BD352054
Bomba de seringaHarvard Apparatus55-2226Uma bomba peristáltica também é aceitável
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Mata-borrão semi-secoBio-Rad Laboratories690BR006163Qualquer sistema de transferência é aceitável, mas os sistemas de transferência descontínuos realizam a transferência eletroforética mais rápida
SNAP i.d. sistema de detecção de proteínas assistido por vácuoEMD MilliporeWBAVDBASEUm modelo atualizado substituiu este instrumento específico, mas deve funcionar tão bem

Referências

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