A Listeria monocytogenes é uma bactéria patogénica gram positiva frequentemente utilizado como um importante modelo para o estudo de parasitismo intracelular. Imagiologia tarde L. monocytogenes fases de infecção dentro do contexto de telas de ARN pequenos interferentes permite o estudo global de vias celulares necessários para a infecção bacteriana de células hospedeiras alvo.
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Artigo de método
Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Patógenos intracelulares bacterianas podem ser concebidas como ferramentas moleculares para dissecar as cascatas de sinalização celular, devido à sua capacidade de manipular requintadamente e subverter as funções das células que são necessários para a infecção dos tecidos-alvo do hospedeiro. Entre estes agentes patogénicos bacterianos, Listeria monocytogenes é um microrganismo gram-positivo que tem sido usada como um paradigma para parasitismo intracelular na caracterização das respostas imunes celulares, e que tem desempenhado as funções instrumentais na descoberta de vias moleculares que controlam citoesqueleto e membrana dinâmica de tráfico. Neste artigo, os autores descrevem um ensaio microscópico robusto para a detecção de níveis de infecção celular final de L. monocytogenes baseado na marcação fluorescente do inLC, uma proteína bacteriana segregada que se acumula no citoplasma de células infectadas, o ensaio pode ser acoplado a high-throughput telas pequenas automatizados ARN interferentes, de modo a characterize vias de sinalização celular envolvidas no cima ou para baixo-regulação da infecção.
Introdução
A bactéria Gram positiva Listeria monocytogenes é um agente patogénico de origem alimentar que invade células hospedeiras, interrompe a sua internalização vacúolo e replica-se no citoplasma das células hospedeiras 1. L. monocytogenes facilidade de manipulação no âmbito de laboratório (crescimento rápido, uma baixa toxicidade para os indivíduos saudáveis) associada à persistência de traços de virulência da bactéria observadas em modelos celulares e animais (actividade hemolítica, leucocitose) permitiu o seu uso inicial em 1960 como um modelo para a maior o estudo do parasitismo intracelular e para o estabelecimento dos fundamentos teóricos....
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Protocolo
1. Preparação de culturas celulares e bacterianos, ferramentas de transfecção e Anticorpos Primários
- Prepare uma placa de ágar fresco para isolar L. indivíduo monocytogenes colónias a partir de um estoque de glicerol bacteriana (50% glycerol/50% saturada de cultura durante a noite de bactérias líquido) mantida a -80 ° C.
- Usando uma cremalheira de alumínio (mantidos à temperatura de -80 ° C) para o transporte de um estoque de glicerol congelado de bactérias, bactérias estrias sobre uma infusão de cérebro e coração (BHI) em placas.
- Incubar a placa a 37 ° C durante 48 horas (ou até que as colónias bacterianas individuais p....
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Resultados
Marcação fluorescente de citoplasmática inLC fornece uma leitura robusta para a infecção de células por L. monocytogenes, como ilustrado na Figura 1: a célula central na micrografia é altamente infectados pela estirpe P14.PrfA * 23, uma vez que pode ser observada na imagem de contraste de fase (setas, Figura 1A) e confirma-se por o sinal de DAPI onde bactérias individuais podem ser claramente distinguidos (Figura 1B). A coloração inLC (sobreposta à c.......
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Discussão
Vários parâmetros são fundamentais para o sucesso do nosso protocolo de detecção inLC, incluindo o uso de linhas de células saudáveis que apresentam um número suficiente de citoplasma para permitir uma detecção inequívoca do sinal inLC. No ensaio que apresentamos neste artigo, propomos o uso de células HeLa CCL2, que são particularmente adequados para o nosso ensaio, devido à extensão de seu espaço citosólico; outros clones HeLa como as células HeLa Kyoto exibir um citoplasma menor, mas pode ser usado com nosso protoc.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Pesquisa em P. Cossart laboratório é apoiado pelo Instituto Pasteur, o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, o Institut National de la Recherche Agronomique, ERC avançada Grant (233348), a Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), a Fundação Louis-Jeantet ea Fondation Le Roch Les Mosqueteiros. AK é um beneficiário de uma bolsa de estudos do Pasteur-Paris International University Doutorado Programa / Institut Carnot Maladies Infecciosas. Agradecemos a Jason Mercer para otimizar o protocolo de transfecção celular.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Infusão de coração cerebral Bacto | BD | 237500 | Para preparação líquida de BHI |
| Ágar Bacto | BD | 214010 | Suplemento ao BHI líquido para placas de ágar BHI Soro |
| bovino fetal inativado por calor | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamina RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicina | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldeído (16%) | EMS | 15710 | Prepare-se fresco antes de cada experimento |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 Dyomics | 647-33 | ||
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Placa de cultura de células de microscopia preta de 384 poços | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscópio | Zeiss | 431007 9901 | |
| câmera sCMOS | Andor | Neo | |
| Software de análise de metamorfos | Dispositivos Moleculares | 4000 | |
| Software de análise CellProfiler | Broad Institute | Software público disponível em http://www.cellprofiler.org/ |
Referências
- Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
- Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal ....
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 6/25/2014. Citeable Link.
A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).
