Simulando pâncreas Neuroplasticidade:<em&gt; In Vitro</em&gt; Dual-neurônio Plasticidade Assay

Resumo

Plasticidade neuronal é uma característica cada vez mais reconhecida, mas não suficientemente entendido do gastrointestinal (GI). Aqui, no exemplo de desordens pancreáticas humanas, apresentamos um ensaio neuroplasticidade in vitro para o estudo da plasticidade neuronal no tracto gastrointestinal, a nível tanto morfológica e funcional.

Resumo

A neuroplasticidade é uma característica inerente do sistema e gastrointestinal (GI) inervação nervoso entérico em condições patológicas. No entanto, o papel fisiopatológico neuroplasticidade em doenças GI permanece desconhecido. Novos modelos experimentais que permitem a simulação e modulação da GI neuroplasticidade pode permitir apreciação aprimorada da contribuição da neuroplasticidade em doenças gastrointestinais particulares, tais como o câncer de pâncreas (PCA) e pancreatite crônica (PC). Aqui, apresentamos um protocolo para a simulação da neuroplasticidade pancreático em condições in vitro, utilizando-nascido gânglios rato dorsal root (DRG) e plexo mioentérico (PM) neurônios. Esta abordagem dual-neurônio não só permite a monitorização de ambos neuroplasticidade órgão intrínseca e extrínseca, como também representa uma ferramenta valiosa para avaliar a morfologia neuronal e glial e eletrofisiologia. Além disso, permite a modulação funcional de conteúdos microenvironmental fornecidos para o estudo de sua Impact em neuroplasticidade. Uma vez estabelecido, o ensaio neuroplasticidade presente traz o potencial de ser aplicável ao estudo de qualquer órgão em neuroplasticidade GI.

Introdução

Alterações no (GI) morfologia gastrointestinal nervo e densidade chamaram a atenção de gastroenterologistas e patologistas por um longo tempo, mas a sua relevância para a fisiopatologia das doenças GI permanece desconhecida ^1-3. De fato, vários distúrbios GI altamente comuns, tais como gastrite, esofagite de refluxo, colite, diverticulite e apendicite estão associados com o aumento da densidade de inervação em áreas de tecidos inflamados ^1. No entanto, nenhuma atenção genuína até agora tem sido dada aos mecanismos e significado da neuroplasticidade no trato GI. Não nervos GI morfologicamente alteradas diferem dos nervos normais GI, ou seja, o estado normal do sistema nervoso entérico, em termos da sua função? Quais são as implicações de conteúdo neuropeptídeo / neurotransmissor alterado nos nervos plástico entéricas? A neuroplasticidade periférica sempre implica sinalização alterados para o sistema nervoso central? E onde estão as projeções centrais do extri plásticoNSIC caminhos neurais GI? Uma longa série de questões-chave pode ser facilmente gerada quando se olha para a escassez de nosso conhecimento sobre os aspectos funcionais do GI neuroplasticidade.

O estudo do GI neuroplasticidade a nível funcional requer modelos experimentais válidos, reprodutíveis e ainda facilmente aplicáveis. Em uma época de crescente popularidade e aceitação de modelos geneticamente modificados condicionais do mouse (GECoMM), tais em ambientes vivo suportar o potencial para elucidar anteriormente desconhecidas facetas do GI neuroplasticidade de uma forma realista ^1. No entanto, o design e produção de GECoMM continua caro, trabalhoso e, principalmente, demorado. Além disso, elas requerem a priori selecção do alvo a ser condicionalmente modulada no rato geneticamente alterado (por exemplo, a sobre-expressão transgénica do factor de crescimento do nervo / NGF em células epiteliais intestinais). Assim, para a design de um GECoMM bem sucedido, os pesquisadores precisam de alguns indicadores (por exemplo, de dados experimentais anteriores) de um alvo de valor, ou seja, a molécula de interesse (aqui NGF) pode pelo menos esperar para exercer alguns efeitos biologicamente relevantes sobre os nervos gastrointestinais.

Tais indicadores podem ser facilmente derivadas a partir de modelos in vitro adequados, em que os subtipos de células isoladas a partir do microambiente complexo de um sistema in vivo podem ser co-cultivadas selectivamente de forma heterotípica ^4-7. A modulação de alvos moleculares em tal configuração de cultura heterotípico é, em média, tecnicamente menos pesado, mais rápido, e pode, portanto, ajudar na pré-filtragem de alvos válidos para a verificação em estudos in vivo.

Recentemente, apresentamos um ensaio in vitro neuroplasticidade, que foi concebido para simular o aumento da densidade neural e hipertrofia de ne intrapancreáticarves em câncer pancreático humano (PCA) e pancreatite crônica (PC) tecidos. Aqui, os neurônios derivados de recém-nascido rato gânglios da raiz dorsal (DRG) ou plexo mioentérico (MP) foram expostos a extratos de tecidos de CaP ressecadas cirurgicamente ou CP tecidos espécimes e comparados com aqueles cultivados em pâncreas humano normal (NP) extratos de tecidos ^5. Em vez de extratos de tecidos, também se pode usar sobrenadantes linha celular para estudar o impacto de tipos de células selecionadas em neuroplasticidade. Quando combinados com uma medição morfométrica padronizado, o ensaio neuroplasticidade apresentado permite a avaliação válidas e reprodutível de plasticidade neuronal em resposta a diferentes microambientes pancreáticas. Em particular, permite a simulação de um) neuroplasticidade morfológico, isto é, as alterações no crescimento de neurites, e de tamanho padrão de ramificação neuronal, e 2) a neuroplasticidade funcional, isto é, alterações na excitabilidade de neurónios periféricos. Além disso, não só periférica (isto é, Entérico), mas também central (por exemplo, DRG ou segunda ordem espinal) neurónios pode ser incluído no presente ensaio, para avaliar a sua reacção morfológica e funcional para diferentes teores de tecido gastrointestinal. Neste vídeo tutorial, vamos demonstrar o protocolo técnico para a realização deste ensaio e discutir suas vantagens e fraquezas. Além disso, chamamos a atenção para a aplicabilidade da noção básica deste ensaio para o estudo da neuroplasticidade em qualquer órgão GI.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais em animais no protocolo de seguir as orientações de cuidados de animais da Technische Universität München, Alemanha.

1. Mídia / Extrato de Preparação

1. Homogeneização Tissue
   A qualidade de homogeneização de tecidos é crítica para a subsequente detecção de alterações neuroplásticas nos neurónios em cultura. Aqui, um homogeneizador é recomendado que permite a dissociação de tecidos sem grande aumento na temperatura do tecido.
   1. Transferir 5 x 5 mm x 5 mm cubos de tecido pancreático directamente a partir de -80 ° C em azoto líquido e lugar numa fase sólida no homogenator tecido. O homogenator ideal seria dissociar o tecido rápido o suficiente, sem permitir que se descongelar.
   2. Imediatamente após a dissociação, ressuspender o, homogeneizado em pó semelhante a sólido em 300-500 ul de 0,1 x tampão fosfato salino (PBS). Aqui, não use qualquer tampão de lise (como RIPA), pois isso pode lisar os neurônios.
   3. Centrifugar os homogeneizados por pelo menos 15 minutos na velocidade máxima de sua centrífuga de bancada (por exemplo, 21.130 xg). Recolhe-se o sobrenadante claro, que representa o extracto de tecido.
2. Sobrenadantes de linha celular
   1. Permitir que as células de interesse, pelo menos, atingir 70 - 80% de confluência em meio de crescimento normal.
   2. Normalmente, esses meios contêm componentes do soro e podem exercer efeitos incontroláveis ​​no crescimento neuronal. Portanto, depois de atingir a densidade celular desejada, lavar as células com pelo menos 3x-cultura de células de grau PBS e colocá-las em meio sem soro (SFM) por até 48 horas.
      Nota: Aqui, consideramos que algumas células (como células estreladas pancreáticas) pode precisar de soro em sua mídia em crescimento a fim de manter seu estado e estrutura normal. Nesses casos, realizar diluições de soro de série no meio da célula de interesse, a fim de encontrar o conteúdo soro possível menor necessário para functio celular intactan.
   3. Medir a concentração de proteína do homogenato de tecido ou de sobrenadantes de células por meio de ensaio de proteína de Bradford. Embora estes valores variam dependendo do tipo de tecido e de células, por extractos de tecido pancreático, seria de esperar um intervalo de concentração entre 5-12 mg / mL, e de sobrenadantes de linha celular entre 3-8 mg / mL.

2. Alíquota de Extratos e sobrenadantes de células

Dependendo da concentração a ser utilizada no ensaio, a concentração final do extracto sobrenadante ou no meio neuronal deve ser de 100 ug / ml ^5,8.

Nota: Para um ensaio com neurónios crescendo em 500 ul de meio, em cada poço de uma placa de 24 poços, o que precisa de 50 ug de proteína em cada extracto ou sobrenadante por poço. A uma concentração típica de cerca de 10 mg / mL do extracto, seria necessário 5 ul de extracto / sobrenadante de cada poço. Em cada setting realizada como uma triplicado, isto corresponderia a 15 ul de extracto / sobrenadante. Para diferentes tipos de tecidos ou células, realizar diluições seriadas do extrato final ou concentração do sobrenadante e comparar os efeitos neurotróficos observadas entre diferentes concentrações do extrato / sobrenadante.

3. Isolamento de neurónios

Uma vez que a coleta de extrato / sobrenadante é terminado, continue com o isolamento dos neurônios.

1. Para neurônios DRG, colete cervical para lombar DRG de ratos recém-nascidos entre o dia pós-natal (P) 2-12 após decapitação e dissecação estereomicroscópica de DRG (Figura 1A). Para se ter neurônios DRG suficientes para uma placa de 24 poços, coletar todos cervical a lombar DRG de um rato recém-nascido (igualando 52 DRG) por placa.
   1. Cortar o periférico (neural) e as projeções centrais (raízes) de DRG por meio de microtesoura.
      Deixando as projeções no lugar impede trituração e aumenta tele risco de contaminação por fibroblastos de cultura.
2. Para os neurónios MP, cortar o mesentério do intestino delgado e manual e cuidadosamente retirar seromuscular do intestino delgado (para um protocolo detalhado para o isolamento MP, referem-se a Schäfer et al. ^9, Figura 1B). Para MP, recolher o plexo de dois ratos por 24 bem-placa.
   Nota: Tente ser o mais suave possível, a fim de evitar as lágrimas na camada seromuscular uma vez que dificultam a sua separação bem sucedida do intestino delgado.
3. Recolhe-se o DRG e seromuscular em meio essencial mínimo gelada (MEM) fornecido com gentamicina (20 mg em média 500 ml) e o metronidazol (2,5 mg em 500 ml de meio).
4. Após a recolha de DRG, incubar em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) fornecido com colagenase tipo II para 20-30 min. Para o isolamento do MP, incubar em colagenase de tipo entre 1-3 horas, dependendo da idadedo animal (Figura 1C).
5. Para MP, recolher os pedaços MP net-like sob microscópio estereoscópico e transferir para MEM gelada.
6. Em seguida, triturar o DRG e MP através de seringas com a diminuição do diâmetro.
   Nota: trituração excessiva pode destruir os neurônios, mas menos que as células da glia.
7. Uma vez que o meio contendo o DRG ou MP tornou-se turva, centrifugar a suspensão a 93,9 g durante 5 min, o meio de descarte e ressuspender em meio Neurobasal (suplementado com 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 0,5 mM de L-glutamina e 2% de B-27).
8. Contar o número total de células (isto é, neurónios e células da glia), por meio de um hemocitómetro.
   Nota: o número de células necessário é dependente do parâmetro de medição. Para a quantificação da densidade de neurites, é preciso culturas mais densas e assim um número maior de células do que para a medição do crescimento de neurites, o tamanho perikaryonale padrão de ramificação de neurônios individuais. Para medições de densidade de neurite, use por exemplo, 10.000 células (neurônios + glia) / bem ou 1.500 neurônios / poço. Para a morfometria de neurônios individuais, breve (1 minuto de duração) trypsination de células e propagação de 2.500 células / poço ou 400 neurônios / bem é recomendado. O rendimento típico de células obtidas a partir de um rato é de cerca de 300.000-500.000 células.
9. Semente as células em lamelas de 13 mm, que foram revestidas com a noite anterior e no topo das cavidades com meio Neurobasal (suplementado com 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 0,5 mM de L-glutamina e 2% de B-27) (Figura 1D).
   Nota: O uso de poli-D-lisina (40 mg / m ²⁾ OU lamelas (1 mg / ml de cada um) revestida com revestimento de ornitina-laminina-e. Células anexar a poli-D-lisina extremamente rápida, tornando-o adequado para experiências em que são necessárias muitas células (isto é, as medições de densidade de neurites). Apego à laminina é de alguma geralo que mais fraca, mas a laminina é um promotor forte de proliferação de neuritos. Portanto, para medições em ramificação neuronal e duração da neurite, preferem ornitina / laminina-revestimento.
10. Permitir que as células anexar aos poços durante a noite. No dia seguinte, preparar os meio suplementado com extracto (a uma concentração de extracto / sobrenadante final de 100 ug / ml).
11. Aspirar o meio de semeadura, e realizar uma lavagem opcional, muito gentil com PBS, em seguida, pipeta lentamente o / suplementados com sobrenadante mídia extrato (Figura 1E).
12. Deixe as células crescem para 48 horas. Aspirar a mídia e corrigir em paraformaldeído a 4% para a imunocoloração (Figura 1F).
13. Realizar coloração dupla imunofluorescência utilizando específico neurônio-(por exemplo beta-tubulina III) e específicos de células gliais (por exemplo glial fibriallary proteína ácida / GFAP) marcadores (Figura 1G).
14. Para a morfometria, usar um microscópio de luz invertido equipado com uma câmera CCD em combinação wiª software automatizado que permite a medição da densidade de neurite (ver tabela).
15. A densidade de neurite de culturas neuronais é medido em 4-5 fotomicrografias representativas com aumento de 200x de 4 regiões diferentes de crescimento mais denso em cada lamela sobrepondo a 50 mm x 50 mM grade e contando a densidade de fibras por metro quadrado medido nas fibras de cruzamento. Neuritos, número de ramificações por neurônio dizer, a duração média do ramo eo tamanho perikaryonal pode ser medido a partir de selecionados aleatoriamente 30 neurônios solitários de cada lamela marcando as neurites e pericários (Figura 1H).

Resultados

Neuroplasticidade morfológica

Na faixa etária indicada de ratos recém-nascidos (P2-12) e as densidades de semeadura, MP e DRG neurônios já construir redes neuronais densas após 48 horas (Figura 2A). Comparação da densidade neurite entre os neurônios cultivados em CaP, PB e extratos NP revela maior densidade de neurônios DRG neurite em CaP ou extratos CP do que em extrato NP (Figura 2A) ^5. Nós particularmente prefiro neurônios MP para medi...

Discussão

O presente protocolo destina-se a ilustrar a metodologia por trás do ensaio neuroplasticidade pancreática in vitro que foi recentemente desenvolvido pelo nosso grupo para estudar os mecanismos de neuroplasticidade na CaP e CP ^5. O protocolo envolve um procedimento de três dias, que pode ser facilmente aplicado uma vez o cantor ganhou experiência suficiente no isolamento e cultivo de DRG e MP neurônios. Além disso, representa uma ferramenta valiosa para estudar a reacção concomitante do entérico e gli...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bromidrato de poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P1149
Ornitina/laminina	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm Lamínulas	Merck		Para uso em placas de 24 poços
Dismembranador S	Sartorius
	Milipore	MAB1637	concentração 1:200
Anti-GFAP-anticorpo	DAKO	M0761	concentração 1:400
Tampão RIPA + inibidor			Qualquer fornecedor
Meio neurobasal	Gibco/Life Sciences	21103-049
B-27 Suplemento	Gibco/Life Sciences	17504044	Sabe-se que a qualidade do B-27 depende do número do lote
Gentamicina/Metronidazol			Qualquer fornecedor
Mínimo essencial meio	Gibco/Life Sciences	31095-029
Hank' s Solução Salina Balanceada (HBSS)	Gibco/Life Sciences	24020133	Melhora a atividade da colagenase quando contém Ca/Mg
Colagenase tipo II	Worthington Biochemical	CLS-2	Obtém lotes com pelo menos 200 U/mg de atividade
Tripsina-EDTA 0,25%	Gibco/Life Sciences	25200056
4% Paraformaldeído			Qualquer fornecedor
analySIS docu software	Olympus

Anticorpo anti-beta-III-tubulina de protease