Fácil medição de Difusão Coeficiente de EGFP-tag Plasma Proteínas de Membrana Usando k-Space espectroscopia de correlação de Imagem

Resumo

Este documento fornece um guia passo a passo para a técnica de análise de flutuação k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) para medir coeficientes de difusão de fluorescente etiquetado proteínas da membrana plasmática em células de mamíferos vivos.

Resumo

Difusão lateral e compartimentalização de proteínas da membrana plasmática são fortemente regulados em células e, assim, estudar esses processos irão revelar novas perspectivas para a função da proteína da membrana plasmática e regulação. Recentemente, k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) ¹ foi desenvolvido para permitir medições de rotina de coeficientes de difusão diretamente a partir de imagens de proteínas da membrana plasmática marcados fluorescente, que evitaram desvios sistemáticos introduzidos pelo fotofísica sonda. Embora a base teórica para a análise é complexo, o método pode ser implementado por não-especialistas, utilizando um código livremente disponível para medir os coeficientes de difusão de proteínas. CCI calcula uma função de correlação de tempo a partir de uma imagem Pilha de microscopia de fluorescência após a transformação de Fourier de cada imagem para (k-) espaço recíproco. Subsequentemente, transformar média circular, logaritmo natural e linear encaixa para a função de correlação obtém-se o coeficiente de difusão. Estedocumento fornece um guia passo-a-passo para a análise de imagem e medição de coeficientes de difusão via CCI.

Primeiro, uma sequência de imagens de alta taxa de quadros de uma proteína da membrana plasmática fluorescente etiquetado é adquirido através de um microscópio de fluorescência. Em seguida, uma região de interesse (ROI) evitando organelas intracelulares, vesículas em movimento ou salientes regiões da membrana é selecionado. A pilha de ROI é importado para um código disponível gratuitamente e vários parâmetros definidos (ver secção Method) são definidos para análise CCI. O programa então gera uma "inclinação das encostas" complô das funções de correlação tempo k-espaço, eo coeficiente de difusão é calculado a partir da inclinação da trama. Abaixo está um procedimento passo-a-passo CCI para medir o coeficiente de difusão de uma proteína de membrana usando o canal de água aquaporina renal-3 marcado com EGFP como um exemplo canônico.

Introdução

A organização espaço-temporal quadridimensional e mobilidade lateral de proteínas da membrana plasmática estão fortemente regulada e pode desempenhar um papel na função da proteína, actividade e interacções proteína-proteína. Difusão lateral de proteínas da membrana plasmática, tradicionalmente tem sido estudada pelo cálculo de coeficientes de difusão para partículas individuais de lapso de tempo de imagem de ponto quântico ou tingir proteínas da membrana plasmática rotulados ^2-4. Esta abordagem requer a inserção de uma etiqueta extracelular da proteína de membrana de plasma para quantum dot ou marcação com corante, o que pode comprometer a dobragem e funç....

Protocolo

Aquisição de proteínas marcadas com EGFP da membrana do plasma para análise CCI pode ser feito num microscópio de epifluorescência, uma configuração TIRF ou num microscópio de disco giratório definido para adquirir imagens da membrana de interesse. O tamanho do pixel de câmara, assim como o tempo entre os quadros de imagem é necessária para a análise. Sequências de imagens de 100-1,200 quadros em uma taxa de quadros de 4-30 Hz pode ser usado para a análise. Durante a aquisição, é importante para manter a membrana no foco durante toda a duração da imagem e o foco sobre uma fracção de membrana plana, em que a fluorescência é uniformemente distribuída. Movendo-se vesícu....

Resultados

Para adquirir pilhas de imagens adequadas a serem analisados ​​com CCI, podem ser utilizados diferentes sistemas de microscópio. É possível analisar sequências de imagens de um microscópio de epi-fluorescência, bem como uma configuração de disco TIRF ou spinning. A membrana deve ser plana, sem grandes organelas celulares em movimento ou em movimento vesículas / objetos. Este trabalho apresenta uma seqüência de imagens de lapso de tempo de AQP3 marcadas com GFP em células MDCK ao vivo de imagens em um microscópio disco g.......

Discussão

Este artigo apresentou um panorama detalhado passo-a-passo de como aplicar o método de análise de CCI para determinar coeficientes de difusão de imagens de microscopia de proteínas marcadas com proteínas fluorescentes. A análise é independente da escolha da sonda com uma gama dinâmica muito ampla na densidade rotulagem e pode assim ser também aplicado a proteínas marcadas com pontos quânticos, bem como corantes e proteínas fluorescentes, tais como a EGFP.

Para calcular os coeficientes de dif.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752< / a >
canamicina	Gibco	15160070
estreptomicina	Gibco	11860038
meio livre de vermelho de fenol	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418 < / a >
HEPES		Gibco
Aparelho
Microscópio de Disco Giratório	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Câmera	Andor	Ixon +

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