Summary
Tab af stabilitetsrefleksen har længe fungeret som en standard adfærdsmæssige surrogat for bevidstløshed, også kaldet hypnose, i forsøgsdyr. Ændringer i flygtigt anæstetikum følsomhed forårsaget af farmakologiske midler kan påvises med en nøje kontrolleret high-throughput vurdering system, som kan tilpasses til levering af enhver inhaleret terapeutisk.
Abstract
En ønskelig endpoint af generel anæstesi er den tilstand af bevidstløshed, også kendt som hypnose. Definition af hypnotisk tilstand hos dyr er mindre ligetil end det er i menneskelige patienter. En meget brugt adfærdsmæssige surrogat for hypnose hos gnavere er tabet af stabilitetsrefleks (LORR), eller det sted, hvor dyret ikke længere reagerer på deres medfødte instinkt for at undgå sårbarhed dorsale tilbagelænethed. Vi har udviklet et system til vurdering LORR i 24 mus på samme tid, mens omhyggeligt kontrollere for potentielle confounds, herunder temperatursvingninger og varierende gasstrømme. Disse kamre tillader pålidelig vurdering af bedøvelsesmiddel følsomhed som målt ved latenstid for at vende tilbage til den oprettende refleks (RORR) efter en fast bedøvelsesmiddel eksponering. Alternativt bruge trinvise stigninger (eller fald) i anæstesikoncentrationen, kamrene også muliggøre fastlæggelse af en befolkning følsomhed over for induktion (eller fremkomst) som målt vedEC 50 og Hill skråning. Endelig kan de kontrollerede miljøkamre her beskrevne tilpasses til en bred vifte af alternative anvendelser, herunder inhaleret levering af andre lægemidler, toksikologiske undersøgelser, og samtidig real-time overvågning af vitale tegn.
Introduction
Generel anæstesi er defineret ved deres evne til at forårsage en reversibel tilstand af hypnose i en bred vifte af arter, men en forklaring på, hvordan sådan en forskelligartet klasse af lægemidler kan alle fremkalde en særegen endpoint fortsat undvigende. En række teorier er blevet postuleret i årenes løb, startende med Meyer-Overton sammenhæng mellem bedøvelsesmiddel potens og lipid opløselighed, som foreslog generelle forstyrrelser membran som grundlag for hypnose 1,2. Flere nye oplysninger tyder på, at protein-targets påvirker neuronal signalering bidrager til bedøvende virkninger. Mus har vist sig at være en uundværlig model for at udforske disse teorier på grund af homologi mellem murine og humane bedøvelsesmiddel lydhørhed. Selvom en mus ikke kan blive spurgt om sin subjektive bevidsthed under generel anæstesi, visse primitive reflekser tjene som nyttige surrogat mål for gnaver hypnose. I de første par dage efter fødslen, mus udvikler en refleksiv oprettende hhvonse der forhindrer dem i at blive passivt placeret i rygleje 3. Dosen af anæstesi, hvor en mus mister sin opretningsrefleksen korrelerer godt med humane hypnotiske doser 4.
Vurdering af tab af opretningsrefleks (LORR) er blevet en udbredt standard laboratorium til at teste bedøvelsesmiddel følsomhed i mus såvel som en række andre arter, herunder rotte, marsvin, kanin, fritte, får, hunde og 5-8. Den dosis af en given anæstetisk hvor LORR vil forekomme for medlemmer af en art er yderst ensartet, men det kan forskydes væsentligt af miljøfaktorer. For eksempel søvnmangel rotter er mere følsomme over for både flygtige og intravenøse anæstetika 9 og rotter med høj aerob kapacitet er mindre følsomme over for isofluran 10. Hypotermi er også blevet vist at nedsætte dosis af talrige anæstetika kræves for hypnose i et stort spektrum af arter 11-14. Forpålideligt identificere den bedøvende dosis, hvor LORR optræder i en gruppe af forsøgsdyr, er det afgørende, at vurderingen miljø følges nøje for at minimere stress, vedligeholde euthermia og levere lige mængder af stof til alle fag. Ikke overraskende, er genetiske faktorer også kendt for at ændre bedøvelsesmiddel følsomhed 15-18. Derfor bør omhyggelig overvejelse også vægt på at kontrollere for genetiske baggrund 19.
Vi har udviklet et apparat, der sikrer ens gasformigt anæstetisk levering til hver af 24 mus under opretholdelse af en konstant 37 ° C miljø. Den gennemsigtige cylindriske design af vores eksponering kamre giver mulighed for hurtig LORR vurdering og nem integration af telemetriløsninger fysiologiske målinger. Har vist, at dette system til at måle isofluran, halothan og sevofluran induktion EC 50 og tid til fremkomst i vildtype-mus 20. Vi har også anvendtdette system til at observere ændringer i bedøvelsesmiddel følsomhed i mus med genetiske mutationer og målrettede hypothalamus læsioner 21-23. Her beskriver vi to måder, hvorpå bedøvelsesmiddel sensitivitet kan vurderes efter en farmakologisk intervention ved hjælp af vores apparat kontrolleret miljø. Steady-state fænotypebestemmelse af flygtigt anæstetikum, induktion og fremkomsten følsomhed kræver 8-10 timer og er dermed bedst skræddersyet til undersøgelser, hvor eksperimentelle betingelser ikke ændrer sig, såsom kronisk eller langtidsvirkende farmakologiske interventioner. Men for korttidsvirkende behandlinger, hvis virkninger spreder sig betydeligt over tid, vi også præsentere en simpel procedure til at vurdere ændringer i stabilitetsrefleks efter stereotaktisk målrettede microinjections eller intravenøse lægemiddelbehandlinger, der væsentligt påvirker bedøvelsesmiddel fremkomst. Disse tests udgør en lille delmængde af de potentielle anvendelser for kontrolleret miljø system, som kan tilpasses til en række subjects i en række arter til at modtage alle typer af inhaleret terapeutisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr, der er skitseret heri er blevet godkendt af University of Pennsylvania Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1.. Oversigt over testapparaturet
- Testapparatet består af 24 klare akryl cylindriske kamre 10 cm i længden og 5 cm i diameter (samlet volumen på 200 ml). Denne størrelse er passende for en typisk 25 g voksen mus. Chambers har porte i hver ende for gas indløb og udløb. Udløbsenden er aftagelige, så at dyrene let kan fyldes i kammeret. Gas portåbninger er omhyggeligt forseglet med Teflon tape, mens gummi O-ring pakninger anvendes til forsegling af den aftagelige ende af de cylindriske kamre.
- Hvert kammer er monteret på et stativ, der sidder inde i et vandbad. Stativet er monteret således, at kun den nederste del af kamrene (under gasindløbene) er neddykket. For stabilitet, bagenden af kammeret hviler på en støtte, så hele Chambis sidder vandret. Dette sikrer en jævn kontakt hele kammeret med badet.
- Polyethylenrør forbinder en ilt tank til en narkosemiddelfordamper, og passerer derefter gennem en 10 l / min flow meter. Slangen deler sig i 25 modstande med lille diameter af samme længde for at sikre lige strøm leveres til hver af de 24 kamre og et middel analysatoren.
- Vakuum linier afslutte hvert kammer i den modsatte ende af gasindløbet. Dette fremmer ensrettet flow, der eliminerer genindånding af udåndet kuldioxid. De vakuum linier kombinerer på en manifold til at forbinde til en in-house sugeledningen. En pop-off ventil langs de vigtigste vakuum linje sikrer atmosfæriske trykforhold inden for hvert kammer.
- Badet fyldes med vand nok til fuldt ud at kontakte bunden af hvert kammer. Vandet cirkuleres gennem bad og holdes ved en konstant 37 ° C ved hjælp af en pumpe.
2. Check System inden eksponeringen
- Cdælen at temperaturen af vandbadet er 37 ° C under hele badet.
- Flow ilt med en hastighed på 5 l / min (200 ml / min per kammer + agent analysator). Nedsænkes hvert kammer under vand og se efter bobler eller indtrængen af vand ind i kammeret, som begge er tegn på lækager. Seal eventuelle lækager, før du begynder eksperimentet.
- For hvert kammer, tilslutte en 500 ml / min flowmåler i linje efter kammeret at sikre, at strømme afbalanceret på tværs af hver af de gasledninger 25. Dette sikrer, at indgang 5 L / min flow vil blive fordelt jævnt, så hvert kammer modtager 200 ml / min flow. Ethvert kammer ikke modtager den forventede flow skulle have sin tilgang og afgang slanger kontrolleres for forhindringer.
- Kalibrer agent analysator til at sikre en læsning på 0,00% isofluran når 100% oxygen strømmer.
3. Implant Temperatur Transponder
- En uge før tilvænning, bedøve hver mus med 2% isofluran.
- Steriliser dorsale halsområdet med betadin.
- Injicer en temperatur transponder subkutant mellem skulderbladene ved hjælp af steril, færdigpakkede injektor nål.
- Overvåg injektionsstedet dagligt for infektion og migration af transponder.
4.. Vænne Dyr til Testing Chambers
- Fire dage før den første vurdering, placere alle musene i individuelle kamre i 2 timer med 100% ilt flyder.
- Gentag trin 4.1 dagligt i de fire dage før vurdering for at undgå de forstyrrende effekter af stress på grund af et nyt miljø.
5.. Udfør farmakologisk intervention, som du ønsker at teste for virkninger på Anesthetic Følsomhed
- Dette indgreb kan være en stereotaktisk injektion i en bestemt del af hjernen 24, intravenøs eller intraperitoneal injektion 25 eller afgivelse af et lægemiddel til et bestemt hjerneområde via kanyle 26.
- Fordi disse procedurer selv kan ændre bedøvelsesmiddel følsomhed i forhold til en naiv dyr, bør en ordentlig kontrol gruppe gennemgå den samme procedure med vehikelinjektioner.
- Sørg for, at farmakologisk intervention har en passende lang virkningsvarighed, hvis du planlægger at gøre en trinvis stigende og / eller faldende bestemmelse af bedøvelsesmiddel følsomhed som vist i trin 6 nedenfor, ellers gå til trin 7..
6.. Vurdere Anesthetic Følsomhed ved hjælp af Trinvis EF 50 Bestemmelse til induktion og Emergence
- Placer hvert dyr i individuelle kamre med 100% ilt flyder.
- Indstil isofluran-koncentration til 0,4% * i 15 min. Under den sidste 2 min af denne periode vurdere de enkelte dyrs opretningsrefleksen ved forsigtigt at rulle kammeret, indtil musen er placeret på ryggen. Den stabilitetsrefleks anses for at være intakt, hvis og kun hvis musen er i stand til at gendanne alleaf sine poter på gulvet af kammeret inden for 2 min.
- * Bemærk, at 0,4% isofluran er en subhypnotic dosis C57BL/6J-mus. Hvis nogle mus mister deres oprettende refleks på det første skridt, den første dosis var for stor og bør reduceres på efterfølgende dage.
- Optag staten stabilitetsrefleks for hver mus og scanne hver mus for temperatur data. En skabelon rekord er vist i tabel 1..
- Øg isofluran-koncentration med ~ 0,05% i 15 minutter og gentag trin 7.2. Fortsæt med at gøre dette, indtil alle dyr har mistet deres oprettende refleks.
- Valgfrit: gentage den samme procedure for faldende trinvise isofluran doser, indtil alle dyrene har genvundet deres oprettende refleks (se trin 6.3).
- For at afslutte eksperimentet, slukke for isofluran og skylle hele systemet med 100% oxygen i 15 min. Dette vil bidrage til at forebygge hypoxi som musene komme sig, før det returneres til deres bure, og vil beskytte experimePil på fra bedøvelse eksponering.
- Valgfrit: Hvis antallet af dyr eller antallet af bedøvende koncentrationer er begrænset på grund af ressourcemangel eller tidsmæssige begrænsninger beretter den kurve-fit parameterestimater-især Hill slope-kan have underappreciated, falsk lave fejl skøn. I sådanne tilfælde kan det være nødvendigt at gentage bedøvelsesmiddel følsomhed måling beskrevet i trin 6.1-6.6 om op til to ekstra eksperimentelle dage til fuldt ud at opnå den sande Hill hældning parameter og dens tilsvarende fejlestimering.
7.. Vurdere kortsigtede ændringer i Anesthetic Følsomhed med Tid til Emergence
- Placer hvert dyr i individuelle kamre med 100% ilt flyder.
- Indstil isofluran koncentration på 1,2%, hvilket svarer til induktion ED 99 for vildtype C57BL/6J-mus 20. Opretholde for 30-60 min, afhængigt af den forventede varighed af virkningen af akut intervention.
- Bekræft LORR ialle dyr af blidt rullende hvert kammer, indtil musene er placeret på ryggen.
- Sluk isofluran og flow 100% ilt. Måle tiden indtil hvert dyr genvinder sin opretningsrefleksen. Dette er defineret ved placeringen af alle fire poter på gulvet af kammeret og bekræftet ved tilstedeværelsen af tre på hinanden følgende forsøg med en intakt opretningsrefleksen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser anvendeligheden af den trinvise LORR assay til bestemmelse af langsigtede effekter af en farmakologisk intervention. Ibotensyre (IBA) er en agonist af glutamaterge N-methyl-D-aspartat (NMDA)-receptor, der ofte bruges som et excitotoksin at forårsage permanente neuronale læsioner. Her injicerede vi 10 nl 1% IBA bilateralt i ventrolaterale præoptiske område (VLPO) af C57BL/6J-mus en uge før test. Størstedelen af neuroner i denne kerne udviser lave satser for fyring under vågenhed og specifikt at øge deres aktivitet under ikke-hurtige øjenbevægelser søvn, rapid eye movement sleep, og med udsættelse for hypnotiske doser af generel anæstesi 23,27-29. Succesfulde læsioner i VLPO skulle forårsage resistens over for isofluran-induceret hypnose. Ved hver stigende isofluran, blev den fraktion af mus, der havde mistet stabilitetsrefleksen plottet mod anæstesikoncentrationen på en log10 skala. Datafor hver gruppe af mus (køretøj-indsprøjtning og IBA-injicerede) blev derefter passer med en sigmoidal dosis-respons-kurve. Fordi denne analyse altid starter med alle dyr opretstående og altid ender med alle dyr have mistet stabilitetsrefleksen, bund og top konstanter blev begrænset til 0 og 1, hhv. De resterende frie parametre af kurverne er EC50 eller koncentrationen af bedøvelsesmiddel, ved hvilken 50% af musene har mistet deres opretningsrefleksen og Hill hældning, hvilket afspejler populationsvariansen under hypnotisk tilstand overgang. En F-test blev anvendt til at forespørge, om en enkelt induktion kurve med delt EC 50 og bakke skråning parametre bedst passer til både køretøj og IBA-grupper, eller om særskilte induktion kurver med forskellige parametre bedre passer til dataene. Frihedsgraderne i denne test opstå fra de rå datapunkter underliggende kurvetilpasningen og dermed afhænge af antallet af bedøvende testede koncentrationer, og antallet af parametre, der er fit-EC 50 og Hill hældning i dette tilfælde. Trinvis fremspiring data blev analyseret og modelleret identisk med data for induktion. Bemærk, at EC50 for fremkomsten er næsten altid lavere end for induktion på grund af bedøvelsesmiddel hysterese også kendt som neurale inerti 30. I modsætning til de forventede resultater, dyr, som fik IBA i VLPO viste ingen signifikante forskelle i EC 50 eller Hill hældning for induktion eller fremkomst i forhold til køretøjets-indsprøjtning kontroller (F 2,80 = 1,73 og p = 0,184 for induktion, F 2, 88 = 2,89 og p = 0,061 for fremkomst). Dette indikerer, at mus VLPO neuroner er resistente over for læsion med 1% IBA, en kendsgerning bekræftet med post mortem histologi (ikke vist). Lu et al. har tidligere vist, at en dosis på 10% IBA er påkrævet for at læsion rotte VLPO 31, men histologisk undersøgelse af muse VLPO efter injektion af 10% IBA viste også nogen betyoverhøjde celletab (ikke vist). Rotten VLPO er kendt for at udtrykke NMDA-receptorer 32. Siden 10% IBA er i stand til at udøve en akut effekt på bedøvelsesmiddel følsomhed, når injiceres i VLPO (se figur 2, diskussion nedenfor), det hævder, at musen VLPO også skal have de NMDA-receptorer, der er nødvendige for IBA handlinger. Således grunden til uoverensstemmelsen mellem arter forbliver uklar. Vellykket mus VLPO læsioner er blevet opnået ved hjælp af en målrettet galanin-saporin 23.
Selvom IBA ikke har en langsigtet effekt på isofluran følsomhed, når injiceres i VLPO, forventes den akutte excitatoriske karakter af dette stof til at stimulere VLPO neuroner og forbigående øge bedøvelsesmiddel følsomhed. I figur 2 har vi brugt tid til fremkomsten prøve for at demonstrere et stort akut skift i isofluran følsomhed umiddelbart efter bilateral IBA mikroinjektion i VLPO som det fremgår af markant forlængethypnose efter ophør af bedøvelsesmiddel levering (p <0,001). Omvendt mikroinjektion af IBA ind i den nærliggende mediale septum forårsagede ingen ændring i tiden til fremkomst i forhold til køretøjets-indsprøjtning kontroller (p> 0,05). Denne konstatering tilføjer en interessant facet til tidligere arbejde, der viser, at inaktivering af denne kerne strækker sig tid til fremkomsten 33,34. Data for forsøgs-og kontrolgrupperne i tid til fremkomsten test blev gennemsnit og sammenlignet med en envejs ANOVA.
| Tid | Isofluran (% atm) | Mus # 1 | Mus # 2 | Mus # 3 | ... |
| 0.4 | - | - | - | - | |
| 12:15 | 0.45 | - | X | - | - |
| 12:30 | 0.5 | - | X | X | - |
| 12:45 | 0.55 | - | X | X | |
| ... | 0.6 | - | X | X | X |
. Tabel 1 Eksempel på en Log Sheet for Langsigtet Anesthetic Følsomhed Assessment: Hver 15 min bedøvelsesmiddel dosis blev øget med 0,05% og stabilitetsrefleks blev vurderet for hvert dyr. "X" betegner dyr, der havde mistet deres opretningsrefleksen til et givet tidspunkt, og "-" betegner dem, der opretholdt deres opretningsrefleksen.
Figur 1.. Assessment stabilitetsrefleksen En uge efter ibotensyre Injektion i ventrolaterale præoptiske Nuc afLeus: Den langsigtede bedøvelsesmiddel følsomhed analysen blev udført på mus med enten bil eller ibotensyre (IBA) sprøjtes ind i ventrolaterale præoptiske område (VLPO) en uge før test. Induktion og fremkomsten af data for hver gruppe var egnet med en sigmoidal dosis-respons-kurve (induktion i faste linjer, fremkomst i stiplede linier) sammen med 95% konfidensinterval bracketing best-fit kurver (skraverede søjler). Anæstesikoncentrationen blev afbildet på en log10 skala. Overlappende 95% konfidensintervaller er vist i lilla. Den sigmoidal dosis repsonse passer til både køretøj og IBA grupper tyder intet bevis for særskilte bedst-fit kurver baseret på EC 50 og Hill skråning. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Tid til Emergence Efter Lokalt Mikroinjektion af ibotensyre: Umiddelbart før vurdering modtog musene en mikroinjektion af N-methyl-D-aspartat (NMDA)-receptor-agonist ibotensyre (IBA) i ventrolaterale præoptiske kerne (VLPO). Dette område er kendt for at blive aktiveret under isofluran-induceret hypnose. IBA injektion førte til en akut stigning i tid til at vende tilbage vridningsrefleks sammenlignet med vehikel-injicerede kontroller (p <0,001). Tid til fremkomsten af dyr med IBA injiceret i mediale septum afveg ikke fra kontroller (p> 0,05). Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom vurderingen af LORR i en enkelt mus er en tilsyneladende enkel opgave, er det ikke desto mindre vigtigt at opretholde samme fysiologiske forhold mellem fag for at indsamle pålidelige data fra en gruppe af dyr. Den stramt reguleret, høj kapacitet LORR apparat præsenteres her giver en måde at standardisere eksperimenter og maksimere effektiviteten. Ved at følge de grundlæggende principper i varmeregulering og lige flow distribution, kan dette system let genskabt og tilpasses til at passe individuelle eksperimentatorens behov. Kammer størrelse kan skaleres efter andre arter, såsom rotter, og yderligere kamre kan rummes ved at knytte flere filialer point til tilgangen og vakuum. Alle emner er let synlige gennem de klare akryl kamre, hvilket gør det muligt at video rekord forsøg til sekundær post-hoc bekræftelse af resultater. Acryl er også kompatibel med radiofrekvens telemetrisystemer, som kan anvendes til at overvåge temperaturtur, blodtryk og biopotentialer.
Vi præsenterer to forskellige metoder til vurdering af bedøvelsesmiddel følsomhed efter en farmakologisk intervention. Både tid til fremkomsten og trinvise induktion tests kræver eksperimentatoren for at score nærvær eller fravær af vridningsrefleksen. Selv med en eksplicit definition af LORR, såsom "ude af stand til at placere alle fire poter på kammeret gulvet inden for to minutter for at blive rullet på ryggen", kan vurderingen være noget subjektivt. Det er bedst at have den samme behandling-blindet individuel score hvert dyr for varigheden af forsøget for at sikre sammenhæng. Når du vælger hvilken test der skal bruges til bedøvelse følsomhed vurdering bør den forventede længde af effekten fra den farmakologisk intervention være den afgørende faktor. Mange lægemidler har en kort virkningsvarighed, for hvilken den akutte tid til fremkomsten paradigme kan give nyttige oplysninger om bedøvelsesmiddel følsomhed i en begrænset periodetid. Dog kan et lægemiddel fortrinsvis påvirke et dyrs følsomhed over for induktion af hypnose i stedet opstået; ændringer i tid på induktion er ofte svære at opdage, fordi induktion sker hurtigt, og dermed kræver løbende vurdering. Jo længere trinvis test for EC 50 af induktion og fremkomsten kan give oplysninger om både indgang til og udgang fra hypnose. Den samlede længde af forsøget vil afhænge af størrelsen af den af stigninger, der anæstesikoncentrationen ændres ved hvert trin med typiske induktion + fremspiringstestene varighed omkring 8 timer. Faldende bedøvelsesmiddel trinstørrelse omkring den forventede EC50 og øge antallet af dyr i hver gruppe vil give en bedre udstyret dosis-respons-kurve, men også forlænge den tid, der kræves for at fuldføre analysen.
Nogle farmakologiske interventioner kan forskelligt ændre minut ventilation af forsøgsdyr i forhold til deres kontrol. Thans kan forårsage en gruppe til udånder flygtigt anæstetikum i tid til fremkomsten test hurtigere end den anden, således confounding resultaterne. Solt et al. beskrive et godt alternativ metode til afprøvning af bedøvelsesmiddel følsomhed i dette scenario 35.. I deres eksperiment, er systemisk methylphenidat leveret i løbet af konstant isofluran eksponering hos dyr, der allerede har bragt i ligevægt med bedøvelsesmiddel. Potentielle forstyrrende virkninger på det minut ventilation er således udelukket under kontinuerlig bedøvelsesmiddel eksponering som bedøvelsesmiddel optagelse og fordeling i steady-state er præcist afbalanceret metabolisme og elimination. Kamrene beskriver vi kunne let modificeret med en ekstra gastæt port til at tillade passage af rør til intravenøs eller intracerebral drug delivery. Det bør også bemærkes, at den beskrevne 15 min ækvilibrering til hver koncentration af bedøvelsesmiddel i den trinvise assay måske ikke være tilstrækkeligt i visse tilfælde. Anesthetics med en højere opløselighed end isofluran, såsom halothan, vil tage længere tid at nå deres fulde koncentration i vævet. Større dyr og dyr, der større skridt i anæstesikoncentrationen kan også kræve mere tid til at komme i ligevægt. At afgøre, om 15 min er virkelig passende for ligevægt, bør måles bedøvende væv niveauer på samme koncentration af bedøvelsesmiddel på både stigende og faldende lemmer eksponering.
I tilfælde, hvor et dyrs evne til at bevæge er fysisk eller farmakologisk hindrede må LORR ikke tjene som en god erstatningsmålingen af hypnose. Den mest pålidelige og udbredte alternativ er kortikale elektroencefalografiske (EEG) optagelser. Selvom EEG kan være bedre i stand til at opfange mere subtile ændringer i narkose følsomhed, er det væsentligt dyrere at etablere end apparatet vi beskriver. Implantering af EEG-elektroder er en invasiv og tidskrævende procedure, og evnen til at SKAFFESi data fra flere mus samtidigt er ofte begrænset af udstyrets tilgængelighed. Desuden analyse af EEG optagelser er konceptuelt mere abstrakte og vanskelige at fortolke end den simple binære output LORR vurdering. Af disse grunde adfærdsmæssige tests som de her beskrevne er ofte mere brugbare metoder til hurtigt at screene bedøvelsesmiddel følsomhed. Bemærk, at EEG mønstre, der tyder på ophidselse og hypnose ikke kan korrelerer godt med adfærd. LORR og EEG er særskilte endpoints, som både sandsynligt giver nyttige oplysninger om bedøvelsesmiddel følsomhed.
Ud over potentielle lægemiddelkandidater-inducerede ændringer i minutters ventilation og mobilitet, er der flere andre begrænsninger til de heri beskrevne fremgangsmåder. Selvom LORR er en standard surrogat for hypnose på tværs af feltet, de kriterier og metoder, der anvendes for sin måling varierer på tværs af laboratorier. Nogle går, at mus skal roteres ved en konstant hastighed for at vurdere stabilitetsrefleksen. Løbende evaluering logisk indsnævrer den præcise timing med hvilken stabilitetsrefleksen er tabt og / eller vender tilbage, dog kan den handling drejes liggende være mere stimulerende end blot forbliver liggende. Desuden trinvis LORR vurdering er en tidskrævende analyse, der kan forlænges yderligere, hvis 15 minutters ligevægt på hvert trin viser sig at være utilstrækkelige.
På trods af disse begrænsninger, de potentielle anvendelsesmuligheder for denne protokol rækker langt ud over de særlige tilfælde, vi har præsenteret. Det er klart, farmakologiske midler er ikke den eneste metode, som bedøvelsesmiddel følsomhed kan ændres; målrettede læsioner anatomiske abnormiteter og genetiske mutationer alle kan testes ved anvendelse af de samme trinvise EC50 bestemmelse. Den kontrollerede miljø system præsenteres her kan anvendes til at levere nogen form af inhaleret lægemiddel, såsom corticosteroider, antibiotika eller eksperimentelle lægemidler. Evnen til at afsløre mange mus til den samme amoUNT af narkotika på en gang gør dette setup ideel til toksikologiske undersøgelser. Derudover kamre tjene som en ideel postoperative opsving miljø med reguleret temperatur og frisk ilt flow. Dette apparat er nyttigt for enhver instans, hvor de grundlæggende dyr vitale tegn skal overvåges og kontrolleres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af R01 GM088156 og T32 HL007713-18. Vi vil gerne takke Bill Pennie og Michael Carman fra University of Pennsylvania Research Instrumentering Shop for deres hjælp i at samle vores stabilitetsrefleks apparat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Oxygen | Airgas | OX300 | |
| Isoflurane | Butler Schein | Any volatile anesthetic of interest may be substituted | |
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mass flow meter- 10 SLPM | Omega Engineering | FMA-A2309 | |
| Mass flow meter- 500 SCCM | Omega Engineering | FMA-A2305 | |
| Anesthetic agent analyzer/gas indicator | AM Bickford | FI-21 Riken | |
| Heating water pump | Fisher Scientific | 13-874-175 | |
| Temperature transponders | BMDS | IPTT-300 | |
| RF temperature reader | BMDS | DAS-6007 |
References
- Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung? Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 Forthcoming.
- Overton, C. E. Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. , Fischer. Jena. (1901).
- Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3 (3), 566-573 (1974).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27 (1), 30-39 (1993).
- Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine--midazolam--ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121 (1-2), 1-10 (2008).
- Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R.
- Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65 (6), 637-641 (1986).
- Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97 (4), 906-911 (2002).
- Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2 (2), 297-302 (2012).
- Eger, E. I., Saidman 2nd,, J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26 (6), 764-770 (1965).
- Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41 (1), 80-81 (1974).
- Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78 (6), 1152-1156 (1993).
- McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101 (1), 15-19 (1992).
- Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109 (5), 1500-1505 (2009).
- Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2 (2), 178-190 (2011).
- Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32 (Pt3), 553-556 (2004).
- Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via "hit and run" gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (18), 9950-9955 (1997).
- Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91 (3), 720-726 (2000).
- Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6 (1), 13 (2006).
- Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. , (2012).
- Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (4), 1309-1314 (2008).
- Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22 (21), 2008-2016 (2012).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079 (2012).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
- Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5 (10), 979-984 (2002).
- Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111 (6), 1271-1278 (2009).
- Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5 (7), e11903 (2010).
- Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20 (10), 3830-3842 (2000).
- Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14 (8), 1257-1274 (2001).
- Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22 (2), RC200 (2002).
- Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. , (2013).
- Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115 (4), 791-803 (2011).
