O cetoconazol se liga e antagoniza a ativação do receptor X do pregnano (PXR). Telas de alto rendimento de leveduras de mutantes PXR definem uma região única para a ligação ao cetoconazol. Este método genético baseado em levedura descobre novas interações de receptores nucleares com ligantes que se associam a locais de ligação de superfície.
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Artigo de método
Reverter levedura Sistema de dois híbridos para identificar mamíferos Receptor Nuclear Resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Como um regulador fundamental no metabolismo de drogas e inflamação, Pregnane X Receptor (PXR), desempenha um papel importante na patofisiologia da doença ligando metabolismo e inflamação (por exemplo, a esteatose hepática) 1,2. Tem havido muito progresso na identificação de ligantes agonistas para PXR, no entanto, há descrições limitadas de antagonistas droga-como e seus sítios de ligação PXR 3,4,5. Uma barreira crítica tem sido a incapacidade de purificar de forma eficiente a proteína de comprimento completo para estudos estruturais com antagonistas, apesar do facto de PXR foi clonado e caracterizado em 1998. O nosso laboratório desenvolveu uma nova levedura de alto rendimento com base ensaio de dois híbridos para definir um antagonista, de cetoconazol, os resíduos de ligação em PXR 6. O nosso método envolve a criação de bibliotecas de mutações que seriam resgatar o efeito das mutações individuais em FA-2 superfície de PXR o esperado para interagir com cetoconazol. Resgate ou "ganho de função" secomutações nd pode ser feita de tal forma que conclusões a respeito da interação genética de cetoconazol e do resíduo (s) de superfície em PXR são viáveis. Assim, foi desenvolvido um alto rendimento de dois híbridos tela levedura de mutantes PXR interagindo com sua coactivator, SRC-1. Usando esta abordagem, em que a levedura foi modificado para acomodar o estudo da droga antifúngica, cetoconazol, conseguimos demonstrar mutações específicas em PXR enriquecidas em clones incapazes de se ligar ao cetoconazol. Pela lógica inversa, podemos concluir que os resíduos originais são resíduos diretos de interação com cetoconazol. Este ensaio representa um romance, ensaio genético tratável para a tela por sítios de ligação do antagonista do receptor nuclear em superfícies. Este ensaio pode ser aplicado a qualquer medicamento, independentemente do seu potencial citotóxico de levedura, bem como a proteína (s) celular, que não pode ser estudado usando biologia estrutural padrão ou métodos proteomic base. Armadilhas potenciais incluem interpretação de dados (métodos complementares útil), reliance em método único Y2H, experiência em lidar com fermento ou levedura realizando ensaios de dois híbridos e otimização do ensaio.
Introdução
A levedura de dois híbridos (Y2H) ensaio é utilizado para descobrir as interacções proteína-proteína e, mais recentemente, para a descoberta de novas moléculas pequenas que perturbem complexos proteína-proteína de interacção 7, 8, 9, 10, 11. No entanto, as abordagens convencionais deste ensaio, usado para a descoberta de medicamentos ou "hits", não permitem a detecção de resíduos de interação de compostos químicos alostéricos dentro superfícies proteína-proteína, que, quando alterados ainda interagir e permitir o interrogatório dos resíduos alterados 11 . Com efeito, um tal método (s), se possível desenvolver, permitiria um sistema de levedura tratável para avaliação de alto rendimento de resíduos de interacção alostéricos críticos para a interacção proteína-proteína ruptura. No contexto da descoberta da droga, a maneira mais direta de estabelecer a interação de compostos com proteínas envolveria determinação estrutural (por exemplo, cristalização do complexo proteína-inibidor). Estes métodos são cumbersome, utilizar os recursos elaborados e não é tecnicamente viável a realização de estudos estruturais em cada proteína.
Sistemas de rastreio de drogas genética tratável foram estabelecidas em bactérias 1, 2 e outros sistemas modelo como mamíferos de dois híbridos. No entanto, esses sistemas precisam de otimização e sistemas alternativos como Y2H ainda são os mais testados na descoberta de medicamentos. Há limitações que incluem pouca sensibilidade e confiabilidade das interações usando métodos singulares 13, no entanto, um ensaio Y2H único pode ser modificada para responder a perguntas específicas sobre resíduos de interação. No campo da investigação de receptores nucleares, Y2H foi usado para definir as proteínas que interagem 14, no entanto, estas interacções proteína raramente foram utilizados para definir a natureza, em que os ligandos / antagonistas do receptor interajam com complexos proteicos nucleares. Assim, o nosso laboratório concentrado esforços na definição de um método, especialmente para as proteínas receptoras que não sejamprontamente passíveis de proteômica métodos baseados, que desenterrar novela ligante / antagonista interagindo resíduos utilizando uma plataforma baseada Y2H descoberta inversa.
Com base em nossa constatação anterior que o cetoconazol interrompe PXR e seu ativador SRC-1, foi desenvolvido um novo sistema de reverter Y2H que nos permitirá definir e interrogar cetoconazol interagir resíduos em PXR 6. O nosso método baseia-se nas propriedades da proteína GAL4 de levedura, que consiste em domínios separáveis responsáveis pela activação de ligação a ADN e transcricional. A proteína PXR LBD é expressa como uma fusão com o domínio de ligação de LexA de ADN (DNA-BD), enquanto que as de comprimento total de co-activadores de SRC-1 (coactivator do receptor de esteróides 1) as proteínas são expressas como fusões com o domínio de activação de GAL4 (AD ). Interacção entre PXR e SRC-1 As proteínas de fusão conduz à activação da transcrição de GAL4, sítios de ligação que contêm genes repórter β-Lac Z, que é integrado no genom levedurae. Cetoconazol, um antagonista de PXR, interrompe PXR e SRC-1 interacção 15, 16, 17 e que pode detectar a interacção de PXR e SRC-1 na presença ou ausência de cetoconazol após coloração colónias em filtros para a actividade de X-gal. O princípio de Y2H é ilustrada na Figura 1 e o procedimento experimental é resumido na Figura 2.
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Protocolo
1. Construção de fusões PXR e SRC-1 em vetores de levedura
- Amplificação por PCR de PXR LBD humano (107-434 aminoácidos) e comprimento total do SRC-1 humano (1-1401 aminoácidos).
- Use o plasmídeo pSG5-hPXR8 como modelo PXR LBD, use o plasmídeo pCMX-SRC1 como modelos SRC-1.
- Descongele o PCR SuperMix, os modelos de DNA e os primers (consulte Materiais), mantenha-os no gelo.
- Adicione 0,25 μg/μl de molde de DNA 1 μl, pares de primers de 10 mM 2 μl cada, PCR SuperMix 45 μl e adicione H2O para elevar o volume total a 50 μl.
- Defina a PCR em um ciclo de 94 °C por 2 min, 20 ciclos de 94 °C por 30 seg, 55 °C por 30 seg e 72 °C por 2 min e, em seguida, um ciclo de 72 °C por 10 min para extensão. Verifique os produtos de PCR executando o gel de agarose a 1%.
- Clonagem de produtos de PCR em vetores Y2H.
- Purifique os produtos de PCR a partir de gel de agarose a 1%. Digerir o vetor pSH2-1 PXR, LBD, PCR e Y2H com BamHI e SalI; digerir SRC-1 PCR e vetor Y2H pGADNOT com NotΙ e SalΙ. Para fazer isso, adicione 1 μg de DNA, 3 μl de tampão de reação 10x, 1 μl de enzimas de restrição e, finalmente, H2O para trazer o volume total para 30 μl.
- Coloque as amostras de digestão em banho-maria a 37 °C por 1 hora. Verifique a digestão executando em gel de agarose a 1%.
- Purifique amostras de digestão de gel de agarose a 1%, lige produtos de PCR digeridos e vetores Y2H e transforme em células competentes para DH5α.
- Escolha as colônias e isole o DNA do plasmídeo.
- Identifique o DNA do plasmídeo pSH2-1-PXR por digestão BamHI / SalI, identifique o DNA do plasmídeo pGADNOT-SRC-1 por digestão NotI / SalI. Verifique todo o DNA plasmidial positivo por sequenciamento.
2. Ensaios de dois híbridos de levedura
- Inocular a estirpe de levedura em 5 ml de YPAD e incubar durante a noite por agitação constante (220 rpm a 30 °C). Nota: A cepa de Saccharomyces cerevisiae foi CTY10-5d (MATa ade2 trp1-901 leu2-3,112 his3-200 ga l4-gal80- URA3::lexA-lacZ) que contém um gene GAL1-lacZ integrado com operador lexA 10. Para obter células de levedura viáveis resistentes ao cetoconazol, mas aquelas que não carregavam alterações no transportador como causa de resistência aos azóis18-20, novas cepas de levedura CTY10-5d foram obtidas primeiro excluindo ERG3 (erg3Δ) e, em seguida, introduzindo deleção adicional nos genes ERG11 (erg3Δ / erg11Δ) por recombinação homóloga. Os detalhes da construção foram descritos em um manuscrito publicado anteriormente6.
- No dia seguinte (de manhã), inocular a levedura (1:20) em 5 ml de YAPD e incubar para obter uma DO600 ~0,2 por agitação constante (220 rpm a 30 °C).
- Pulverize as células a 2.000 rpm em uma microcentrífuga por 2 min e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave o pellet duas vezes com água autoclavada e uma vez com LiAc 0,1 M.
- Após a lavagem final, rejeitar o sobrenadante e adicionar os seguintes reagentes ao sedimento celular: 240 μl PEG 3500 50% p/v, 36 μl 1 M LiAc, 50 μl 2 mg/ml de esperma de salmão cozido ssDNA, H2O 34 μl. Vórtice para misturar, adicionar 1 μg de pSH-PXR e 1 μg de ADN pGADNOT-SRC-1 e misturar.
- Transferir a mistura para um tubo de poliestireno de fundo redondo, agitar a transformação, misturar (220 rpm a 30 °C) durante 30 min. Mover o tubo para um banho-maria a 42 °C e incubar durante mais 30 min.
- Centrifugue o tubo a 2.000 rpm por 2 min e remova o sobrenadante. Lave o pellet uma vez com água autoclavada.
- Pipete 100 μl de água estéril para o tubo, ressuspenda as células batendo suavemente com os dedos e pipetando, depois coloque em placas de meio de gota de -His/-Leu (formulação por meio de gota de -His/-Leu: 20 g de dextrose, 1,7 g de YNB, 0,67 g de CSM-His/-Leu, 5 g de sulfato de amônio, ágar 1,5%) e incube a 30 ° C por 3-4 dias para isolar os transformantes.
3. Ensaio de filtro X-gal
- Corte a membrana de nitrocelulose no tamanho de uma placa de Petri. Rotule a membrana de nitrocelulose para marcar a orientação.
- Coloque a membrana de nitrocelulose pré-marcada nas colônias de leveduras, certifique-se de que a membrana esteja em contato com a superfície do meio da placa.
- Retirar a membrana, colocá-la com o lado da colónia virado para cima sobre um papel de filtro de 3 mm e colocar a membrana e o papel de filtro a -80 °C durante 15 min.
- Faça uma solução X-gal. Adicionar 50 μl de 20 mg/ml de X-gal e 15 μl de β-mercaptoetanol a 5 ml de tampão Z (1 l de tampão contém 16,1 g de Na,2HPO,4, 7H,2O, 5,5 g de NaH,2PO,4 H,2O, 0,75 g de KCl, 0,25 g de MgSO,4•7H,2O). Se o tampão Z tiver sido mantido a 4 °C, leve-o à temperatura ambiente antes de adicionar esses reagentes.
- Colocar dois círculos de papel de filtro de 3 mm numa placa de Petri e mergulhá-los com 5 ml de solução X-gal. Drene o excesso de tampão da placa de Petri e coloque a membrana de nitrocelulose com a colônia voltada para cima.
- Feche a tampa, certifique-se de que a membrana esteja em contato completo com o papel de filtro e que esteja completamente molhada. Embrulhe a placa de Petri em papel alumínio e incube a 37 ° C por 30 minutos durante a noite.
4. Ensaio de β Líquido
- Cultive levedura em meio líquido -His/-Leu Dropout para OD600 0,7.
- Transfira 1 ml de meio para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugue a 3.000 rpm por 2 min. Descarte o sobrenadante.
- Adicionar 1 ml de tampão Z para ressuspender o pellet, centrifugar novamente a 3.000 rpm durante 2 min. Rejeitar o sobrenadante.
- Adicione 150 μl de tampão Z com 2ME para ressuspender o pellet celular, misture e adicione 50 μl de clorofórmio e 20 μl de SDS a 0,1%. Vortex vigorosamente a amostra por 15 segundos.
- Adicionar 700 μl de solução ONPG (1 mg/ml em tampão Z). Regular o temporizador, incubar a 30 °C durante tempo suficiente para permitir a formação da cor amarela e registar o tempo total de reacção.
- Adicionar 500 μl de 1 M Na2CO3 para interromper a reacção e determinar a absorvância a 420 nm. O branco é 700 μl de solução ONPG mais 500 μl 1 M Na2CO3.
Calcule as Unidades de Miller da seguinte forma: Unidades de Miller = (Å420*1,000)/(Å600*min*ml)
Å420: unidades de absorbância a 420 nanômetros; Å600: unidades de absorbância a 600 nanômetros; min: o tempo de reação em minutos; ml: o volume de reação em ml
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Resultados
Realizamos um ensaio para verificar se poderíamos detectar uma leitura colorimétrica da associação entre PXR e o coativador-1 do receptor de esteroides (SRC-1). Como o levedo possui produção significativa de esteróis, já foi demonstrado anteriormente que a expressão de lacZ em levedo pode ser induzida sem a necessidade de ligante exógeno adicional. Descobrimos que a expressão de lacZ (colônias azuis) também é induzida na linhagem de levedo transformada com PXR e SRC-1; no entanto, não há indução da expressão de LacZ (col...
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Discussão
Em nosso ensaio Y2H modificado, identificamos resíduos importantes para interações de cetoconazol em PXR6. Como o SRC-1 é um coativador (e foi clonado no vetor pGADNot), também testamos se o SRC-1 poderia ativar a expressão de lacZ quando clonado no sistema de vetores pSH e se isso mudaria o perfil de ativação e/ou afetaria o vazamento do ensaio de dois híbridos de levedura. Usando nossos plasmídeos redesenhados, realizamos dois ensaios híbridos em levedura erg3Δ / erg11Δ. Como antes, mostram...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Grants CA127231 e pelo Damon Runyon Foundation Clinical Investigator Award (CI 1502) (para S.M). Gostaríamos de agradecer ao professor Zdenek Dvorak, da Universidade Palacky de Olomouc, República Tcheca, por seus insights úteis sobre a discussão da portabilidade dessa técnica para sua instituição e padronização do protocolo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cepa de levedura CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | Nossa | levedura CTY10-5d de laboratório foi duplamente eliminada ERG3 e ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 . | |
| Meio de Crescimento YPD | BD Biosciences | 630409 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) sem Aminoácidos e Sulfato de Amônio | BD Biosciences | 233520 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| CSM-His/-Leu Mistura Completa de Suplementos MP | Biomedicals | 4250-412 | |
| ONPG (o-Nitrofenil Β-D-Galactopiranosídeo). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Caldo Luria (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
| DNA de Esperma de Salmão Sonicado fervido (10 mg/ml) | Life Technology | 156-017 | |
| Ampicilina | Acros Organics | 61177 | |
| Cetoconazol | Sigma-Aldrich | K1003 | |
| N,N-Dimetilformamida | Acros Organics | 326871000 | |
| Acetato de Lítio | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| 50% PEG-3350 solução, esterilizada por filtro | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Membrana de Nitrocelulose | Whatman | 10402091 | |
| Placa de Petri de 10 cm | Fisher | 875712 | |
| 5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATGATCATGTCC-3'our | lab | PXR LBD primer dianteiro para pSH2-1 | |
| 5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'our | lab | PXR LBD primer reverso para pSH2-1 | |
| 5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'our | lab | SRC-1 primer dianteiro para pGADNOT | |
| 5 ' - Gcggtcgacttattcagtca GTAGCTG -3 ' | our laboratório | SRC-1 a primeira demão reversa para o PCR Supermix | |
| Invitrogen | 11306-016 | platina | |
| nosso laboratório | R0136 | ||
| NotI | nosso laboratório | R0189 |
Referências
- Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
- Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).
- Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists. Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).
- Pondugula, S. R., Mani, S. Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response. Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).
- Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. PXR antagonists and implications for drug metabolism. Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).
- Li, H., et al. Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR. J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).
- Hollenberg, S. M., et al. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).
- Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 74 (1), 205-214 (1993).
- Wang, H., et al. The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor. Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).
- Kalpana, G. V., Goff, S. P. Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).
- Hamdi, A., Colas, P. Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery. TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).
- Battesti, A., Bouveret, E. The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli. Methods. 58 (4), 325-334 (2012).
- Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems. Methods. 58 (4), 317-324 (2012).
- Albers, M., et al. Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins. Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).
- Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics. J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).
- Huang, H., et al. Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole. Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).
- Wang, H., et al. Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs. Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).
- Ghannoum, M. A., Rice, L. B. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).
- Kaur, R., Bachhawat, A. K. The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology. 145, 809-818 (1999).
- White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).
- Serebriiskii, I. G., et al. Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets. Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).
- Yang, L., et al. Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer. Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).
- Zhan, Y. Y., et al. The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK. Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).
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Reimpressões e permissões
