O cetoconazol se liga e antagoniza a ativação do receptor X do pregnano (PXR). Telas de alto rendimento de leveduras de mutantes PXR definem uma região única para a ligação ao cetoconazol. Este método genético baseado em levedura descobre novas interações de receptores nucleares com ligantes que se associam a locais de ligação de superfície.
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Artigo de método
Reverter levedura Sistema de dois híbridos para identificar mamíferos Receptor Nuclear Resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Como um regulador fundamental no metabolismo de drogas e inflamação, Pregnane X Receptor (PXR), desempenha um papel importante na patofisiologia da doença ligando metabolismo e inflamação (por exemplo, a esteatose hepática) 1,2. Tem havido muito progresso na identificação de ligantes agonistas para PXR, no entanto, há descrições limitadas de antagonistas droga-como e seus sítios de ligação PXR 3,4,5. Uma barreira crítica tem sido a incapacidade de purificar de forma eficiente a proteína de comprimento completo para estudos estruturais com antagonistas, apesar do facto de PXR foi clonado e caracterizado em 1998. O nosso laboratório desenvolveu uma nova levedura de alto rendimento com base ensaio de dois híbridos para definir um antagonista, de cetoconazol, os resíduos de ligação em PXR 6. O nosso método envolve a criação de bibliotecas de mutações que seriam resgatar o efeito das mutações individuais em FA-2 superfície de PXR o esperado para interagir com cetoconazol. Resgate ou "ganho de função" secomutações nd pode ser feita de tal forma que conclusões a respeito da interação genética de cetoconazol e do resíduo (s) de superfície em PXR são viáveis. Assim, foi desenvolvido um alto rendimento de dois híbridos tela levedura de mutantes PXR interagindo com sua coactivator, SRC-1. Usando esta abordagem, em que a levedura foi modificado para acomodar o estudo da droga antifúngica, cetoconazol, conseguimos demonstrar mutações específicas em PXR enriquecidas em clones incapazes de se ligar ao cetoconazol. Pela lógica inversa, podemos concluir que os resíduos originais são resíduos diretos de interação com cetoconazol. Este ensaio representa um romance, ensaio genético tratável para a tela por sítios de ligação do antagonista do receptor nuclear em superfícies. Este ensaio pode ser aplicado a qualquer medicamento, independentemente do seu potencial citotóxico de levedura, bem como a proteína (s) celular, que não pode ser estudado usando biologia estrutural padrão ou métodos proteomic base. Armadilhas potenciais incluem interpretação de dados (métodos complementares útil), reliance em método único Y2H, experiência em lidar com fermento ou levedura realizando ensaios de dois híbridos e otimização do ensaio.
Introdução
A levedura de dois híbridos (Y2H) ensaio é utilizado para descobrir as interacções proteína-proteína e, mais recentemente, para a descoberta de novas moléculas pequenas que perturbem complexos proteína-proteína de interacção 7, 8, 9, 10, 11. No entanto, as abordagens convencionais deste ensaio, usado para a descoberta de medicamentos ou "hits", não permitem a detecção de resíduos de interação de compostos químicos alostéricos dentro superfícies proteína-proteína, que, quando alterados ainda interagir e permitir o interrogatório dos resíduos alterados 11 . Com efeito, um tal método (s), se possível desenvolver, permitiria um sistema de levedura t....
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Protocolo
1. Construção de fusões PXR e SRC-1 em vetores de levedura
- Amplificação por PCR de PXR LBD humano (107-434 aminoácidos) e comprimento total do SRC-1 humano (1-1401 aminoácidos).
- Use o plasmídeo pSG5-hPXR8 como modelo PXR LBD, use o plasmídeo pCMX-SRC1 como modelos SRC-1.
- Descongele o PCR SuperMix, os modelos de DNA e os primers (consulte Materiais), mantenha-os no gelo.
- Adicione 0,25 μg/μl de molde de DNA 1 μl, pares de primers de 10 mM 2 μl cada, PCR SuperMix 45 μl e adicione H2O para elevar o volume total a 50 μl.
- Defina a PCR em um ciclo de 94 °C por 2 min, 20 ciclos de 94 °C por 30 seg,....
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Resultados
Realizamos um ensaio para verificar se poderíamos detectar uma leitura colorimétrica da associação entre PXR e o coativador-1 do receptor de esteroides (SRC-1). Como o levedo possui produção significativa de esteróis, já foi demonstrado anteriormente que a expressão de lacZ em levedo pode ser induzida sem a necessidade de ligante exógeno adicional. Descobrimos que a expressão de lacZ (colônias azuis) também é induzida na linhagem de levedo transformada com PXR e SRC-1; no entanto, não há indução da expressão de LacZ (col.......
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Discussão
Em nosso ensaio Y2H modificado, identificamos resíduos importantes para interações de cetoconazol em PXR6. Como o SRC-1 é um coativador (e foi clonado no vetor pGADNot), também testamos se o SRC-1 poderia ativar a expressão de lacZ quando clonado no sistema de vetores pSH e se isso mudaria o perfil de ativação e/ou afetaria o vazamento do ensaio de dois híbridos de levedura. Usando nossos plasmídeos redesenhados, realizamos dois ensaios híbridos em levedura erg3Δ / erg11Δ. Como antes, mostram.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Grants CA127231 e pelo Damon Runyon Foundation Clinical Investigator Award (CI 1502) (para S.M). Gostaríamos de agradecer ao professor Zdenek Dvorak, da Universidade Palacky de Olomouc, República Tcheca, por seus insights úteis sobre a discussão da portabilidade dessa técnica para sua instituição e padronização do protocolo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cepa de levedura CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | Nossa | levedura CTY10-5d de laboratório foi duplamente eliminada ERG3 e ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 . | |
| Meio de Crescimento YPD | BD Biosciences | 630409 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) sem Aminoácidos e Sulfato de Amônio | BD Biosciences | 233520 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| CSM-His/-Leu Mistura Completa de Suplementos MP | Biomedicals | 4250-412 | |
| ONPG (o-Nitrofenil Β-D-Galactopiranosídeo). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Caldo Luria (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
| DNA de Esperma de Salmão Sonicado fervido (10 mg/ml) | Life Technology | 156-017 | |
| Ampicilina | Acros Organics | 61177 | |
| Cetoconazol | Sigma-Aldrich | K1003 | |
| N,N-Dimetilformamida | Acros Organics | 326871000 | |
| Acetato de Lítio | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| 50% PEG-3350 solução, esterilizada por filtro | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Membrana de Nitrocelulose | Whatman | 10402091 | |
| Placa de Petri de 10 cm | Fisher | 875712 | |
| 5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATGATCATGTCC-3'our | lab | PXR LBD primer dianteiro para pSH2-1 | |
| 5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'our | lab | PXR LBD primer reverso para pSH2-1 | |
| 5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'our | lab | SRC-1 primer dianteiro para pGADNOT | |
| 5 ' - Gcggtcgacttattcagtca GTAGCTG -3 ' | our laboratório | SRC-1 a primeira demão reversa para o PCR Supermix | |
| Invitrogen | 11306-016 | platina | |
| nosso laboratório | R0136 | ||
| NotI | nosso laboratório | R0189 |
Referências
- Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
- Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12
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Reimpressões e permissões
