Optimizado coloração negativa: um protocolo de alta capacidade para Examinando pequeno e assimétrico Estrutura de proteínas por microscopia eletrônica

Compreender a função da proteína exige conhecimento da estrutura da proteína. A determinação estrutural é um desafio para as proteínas cujas massas molecular estão dentro de 40 - 200 kDa. A cristalografia de raios-X está limitado por cristalização de proteínas; ressonância magnética nuclear (RMN) é limitado a massas moleculares inferiores a 40 kDa, ao passo que a microscopia crio-electrão (crio-EM) tem dificuldade em ambos aquisição de imagem e reconstruções tridimensionais (3D) de pequenas proteínas, que as massas moleculares são menos a 200 kDa. Notavelmente,% de proteínas mais de 50 têm uma massa molecular na faixa de 40 - 200 kDa ^1,2, como os métodos atuais são um desafio em estudar proteínas desse porte, é necessário um novo método.

Embora a maioria dos microscópios eletrônicos de transmissão (ETM) são capazes de resolução atômica, ou seja, mais de 3 Å de resolução, conseguindo mesmo uma estrutura perto resolução nanométrica a partir de um material biológico é bastante challenGing ^7. Os danos da radiação, baixo contraste, os desvios estruturais, bem como artefatos como desidratação todos os impedem de alta resolução de imagem TEM ^3,8.

Entre as várias abordagens TEM, crio-EM é um método avançado e de ponta para alcançar estruturas de resolução atômicas de macromoléculas altamente simétricas sob condições fisiológicas perto de ^9-12. A amostra de crio-EM é preparada flash de congelação da solução de amostra, a incorporação das macromoléculas em gelo vítreo, que é posteriormente trabalhada a temperaturas criogénicas tais como azoto ou hélio temperaturas do líquido ^13. Cryo-EM é vantajoso em que as amostras não apresentam artefatos e são quase nativa em estrutura ^8-12. Cryo-EM tem suas desvantagens: i) dispositivos adicionais são necessários para ser instalado ou comprado para atualizar um instrumento TEM padrão para uma capacidade de crio-EM. Os dispositivos incluem: anti-contaminador, porta-crio, software modo de baixa dose e sensi baixa dosecâmera CCD tiva, embora os preços destes dispositivos são muito mais baixos do que o preço do próprio instrumento TEM; ii) operação de crio-EM tem mais tempo do que a operação NS. Examinando uma amostra de crio-EM, muitas vezes requer mais tempo para preparar as amostras e operar o instrumento TEM do que a de NS porque crio-EM, é necessário resolver as dificuldades adicionais, incluindo: líquido operação temperatura do nitrogênio, amostra de carga, tração de imagem, gradientes de temperatura, baixa dose modelo de operação, as sensibilidades de radiação das amostras e os limites de dosagem. Estas etapas extras vão diminuir a velocidade de aquisição de dados úteis em relação a aquisição de dados NS, embora algumas imagens crio-EM podem certamente ser obtido em 1 hora ou menos por especialistas crio-los com o instrumento preparado com um gradiente de temperatura equilibrada; iii) os usuários precisam de treinamento adicional, como a manipulação de nitrogênio líquido, congelamento grades crio-EM, a operação em baixa dose, medida de dose, a manipulação da carga, à deriva e conhecimento em proc imagemessing; iv) falta de imagiologia repetível para os mesmos crio exemplar durante as diferentes sessões de TEM. Espécimes Cryo-EM são facilmente danificados pela contaminação de gelo durante a carga e descarga de amostra de / para o instrumento TEM. Este dano é especialmente uma preocupação quando as amostras são difíceis de ser isolados / purificados ^14; v) proteínas pequenas (<200 kDa de massa molecular) são um desafio a ser trabalhada por causa do baixo contraste; vi) a partir de contraste e de ruído elevado de imagens crio-EM reduz o valor da correlação cruzada entre as imagens, portanto, diminuindo a precisão total na determinação da orientação da proteína, conformações e classificações, especialmente para as proteínas que são estruturalmente flexível e, naturalmente, variar em solução ^4,5.

Coloração negativa (NS) é relativamente "antigo" e histórica método que qualquer laboratório, com qualquer tipo EM, pode utilizar para analisar a estrutura da proteína. Brenner e Horne primeiro desenvolveu o conceito of coloração negativa de meio século atrás para examinar vírus ^15. NS é realizado por meio de revestimento da amostra com sais de metais pesados ​​carregados. Este conceito originalmente vindo de microscopia de luz e a prática de incorporar as bactérias em uma solução mancha fornecendo escuridão ao redor dos espécimes, permitindo maior contraste de imagem para ver a imagem negativa ^16. Uma vez que os íons de metais pesados ​​têm uma maior capacidade para dispersar os elétrons em comparação com átomos de menos densas nas proteínas ^17-20, e revestimento de metais pesados ​​mancha permite uma limitação dosagem superior com melhor contraste. Espécime NS pode fornecer imagens de alto contraste ⁸ para facilitar a determinação orientação das partículas e reconstrução 3D de imagens de crio-EM.

NS tradicionais, infelizmente, pode produzir artefatos induzidos por interações mancha em proteínas, como a agregação geral, a dissociação molecular, achatamento e empilhamento ^8,21,22. Para lipídico relacionado proteins, como lipoproteínas ^16,23-30, um artefato comum resulta em partículas que são empilhados e embalados juntos em um rouleaux (Figura 1) ^31-36. Muitos estudos de lipoproteína, tais como a electroforese em gel não desnaturante de poliacrilamida de gradiente, crio-EM estuda ^13,29,37-40, espectrometria de massa de ^39,41, e os dados de difracção de raios-X de ângulo pequeno ⁴² mostra que todas as partículas de lipoproteínas são partículas isoladas naturalmente, em vez de empilhada em conjunto, formando uma rouleaux ^{21,29,30,35,42-45.} A observação da formação rouleaux por NS convencionais é possivelmente causada por interações dinâmicas entre lipoproteínas compostas de apolipoproteínas (APO) e fosfolipídios que são estruturalmente flexível em solução ^{13,29,30,46-49} e sensibilidade para o protocolo NS padrão. Para identificar esse artefacto, apolipoproteína E4 (apoE4) palmitoil-oleoylphosphatidylcholine (POPC) lipoproteína de alta densidade (HDL) da amostra foram utilizados como uma amostra de teste e crioterapiaImagens EM para um padrão artefato livre ^29, a triagem das amostras NS elaborados sob uma série de condições. Ao comparar os tamanhos de partículas e formas obtidas a partir de NS e crio-EM, o tipo específico de reagente de coloração e concentração de sal foram considerados dois parâmetros principais fazendo com que os fenómenos ROULEAUX bem conhecidos. Assim, um protocolo de coloração negativa optimizado (OPNS) foi relatada.

Por OPNS, o fenómeno bem conhecido de rouleaux apoE4 HDL foi eliminado por OPNS (Figura 2A). A análise estatística demonstrou OPNS rendimentos imagens muito semelhantes (menos de 5% do desvio) em tamanho e forma, em comparação com os de crio-EM, no entanto, o contraste foi eliminado. As validações de OPNS foram realizadas por análise de eliminação do artefacto rouleaux de quase todas as classes e subclasses de amostras de lipoproteína ^{6,29,30,50,51,} incluindo a apo AI 7,8 nm (Figura 2B), 8,4 nm (Figura 2C) , 9,6 nm discoidal HDL reconstituídas (rHDL) (Figura 2D), 9,3 nm esférica rHDL (Figura 2E), o HDL no plasma humano (Figura 2F), livre de lípidos de apo AI (Figura 2G), o HDL no plasma (Figura 2H), lipoproteína de baixa densidade (LDL ) (Figura 2I), lipoproteínas de densidade intermédia (IDL) (Figura 2J), lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) (Figura 2K), e lipossomas de POPC (Figura 2D) ^30. Validações adicionais foram realizados por imagiologia pequenas e assimétricas proteínas, incluindo a proteína de 53 kDa de transferência de éster de colesterol (CETP) (Figura 3A - C) ^{de 6,29,} e altamente flexível 160 kDa anticorpo IgG (Figura 4A e B) ^{4,5,29 , 52,} e duas proteínas estruturalmente bem conhecidos, e GroEL de proteassoma (Figura 2 M e N). Para requerer qualquer validação adicional de colleagues, estamos abertos a quaisquer testes cegos sobre este método OPNS.

OPNS como um protocolo de alto rendimento também tem sido utilizada para estudar mecanismo de proteína através de análise de centenas de amostras de pequenas proteínas, tais como foi CETP que se ligam a várias proteínas sob uma série de condições, incluindo (CETP interagindo 4 classes de lipoproteínas, recombinados HDL plasma HDL, LDL e VLDL, com / sem dois anticorpos, H300 e N13, sob vezes 9 de incubação, incluindo 3 min, 20 min, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 24 horas, 48 ​​horas e 72 horas, com menos de 4 proporções molares, por exemplo, 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, e 3 diluições, ou seja, 0,1 mg / ml, 0,01 mg / ml e 0,001 mg / ml, mais amostras de controlo adicionais, incluindo CETP sozinho, LDL sozinho, e VLDL sozinho, com testes de triplos de experiências anteriores por parte de pessoas diferentes) ^6,29. OPNS imagens de CETP fornecido imagens de alto contraste com detalhes estruturais razoavelmente finas; o que nos permite reconstruir com sucesso um mapa de densidade 3D da 53 kDa smaproteína CETP ll (Figura 3D - F) pela reconstrução única partícula. Além disso, as imagens OPNS alto contraste nos fornecer um sinal suficiente de uma proteína individual (Figura 4A - C), o que nos permitiu alcançar a resolução intermediária (~ 1,5 nm) de um único (um objeto, não média) estrutura de anticorpos IgG 3D através do método (Figura 4E - J) tomografia elétron-partícula individual (Ipet) ^5. A descrição detalhada da estratégia ipet reconstrução, a metodologia, os processos passo-a-passo e análise de variações estruturais foram previamente relatados ^4. Um filme sobre procedimentos de reconstrução de anticorpos ipet, incluindo as imagens cruas e resultados intermediários, mapa de densidade 3D ​​e acoplagem estrutural foi também disponível ao público por upload para o YouTube ^5. Comparação das reconstruções 3D a partir de diferentes partículas de anticorpos individuais poderiam revelar a dinâmica das proteínas e cmudanças onformational durante reações químicas ^4,5.

Considerando-se que mais de 50% de proteínas têm massa molecular variando 40-200 kDa ^1,2, o sucesso em imagem destas pequenas proteínas evidenciado que o método OPNS é uma ferramenta útil para empurrar a fronteira EM convencional para determinações estruturais pequenas e assimétricas e um mecanismo de descobertas . Assim, o protocolo detalhada é fornecida abaixo.

1 Preparação da solução fresca de coloração negativa em 1% (w / v)

1. Coloque 1 mg uranilo Formate (UF) do pó em frasco de vidro contendo 100 ml de água deionizada em uma sala ou caixa escura.
2. Agita-se a solução de O / N à temperatura ambiente numa sala escura / caixa. Embrulhe o frasco da solução com papel alumínio para evitar que a luz incida a solução.
3. Filtra-se a solução suavemente, através de 0,2 um (tamanho de poro) de filtro montado em uma seringa de 5 ml. A solução filtrada foi recolhido em várias folhas de alumínio cobertos tubos Falcon. A seringa de filtro também deve ser envolvida com papel de alumínio para evitar a exposição à luz.
4. Filtra-se a solução novamente através de 0,02 um (tamanho de poro) de filtro montado em seringa de 1 ml. A solução foi filtrada e foi recolhido em alíquotas de 2 ml. As seringas e tubos de ensaio a ser coberto com uma folha de alumínio, antes da utilização.
5. Congelar os frascos alíquotas usando uma pinça de cabo longo submergindo os frascos dentro de um recipiente cheio de nitrogênio líquido imediatamentedepois a solução foi filtrada.
6. Transfira os frascos congelados em um freezer -80 ° C para armazenamento e uso futuro.

2 Preparação de Workstation coloração negativa e Incubação Workstation

1. Descongelar um frasco de solução UF 1% em um banho de água regulado para RT. Certifique-se de que a folha de alumínio permanece enrolada em torno do frasco para evitar a exposição à luz.
2. Filtra-se a solução depois de ser completamente descongelado, usando uma folha de alumínio enrolado seringa de 1 ml montado com um filtro de 0,02 ^ m. Coletar a solução filtrada para uma nova folha de alumínio envolto frasco, e colocou-a sobre o gelo dentro de uma caixa de gelo cap coberto espera para o uso.
3. Faça placas de solução pelo dedo empurrando uma folha longa Parafilm ~ 8 polegadas para a superfície de uma placa de cristalização de proteínas vazio. Ele irá gerar linhas de placas circulares com um diâmetro de ~ 5 milímetros. Fazer 6 placas em cada fila lugar as placas Parafilm sobre uma superfície de gelo achatado dentro de gelo contêmer tampa, como uma estação de trabalho de coloração.
4. Pipeta ~ 35 mL de água deionizada em cada um dos restantes três placas em cada linha, e pipetas ~ 35 mL filtrada solução UF para direita três placas em cada linha. Cobrir a estação de trabalho de coloração com uma tampa para evitar a exposição à luz antes de corar as proteínas.
5. Prepara-se uma estação de incubação grade EM preenchendo uma caixa a meio caminho vazio com gelo, e adere ao lado de um gancho que pode ser montado sobre uma base de apoio. Coloque as pinças de exemplo no cabide, nos quais dicas das pinças estão próximas da superfície do gelo. Metade cobrir dicas das pinças por a altura da caixa lábio. Uma caixa de gelo ideal para fazer uma estação de incubação está usando um recipiente pontas de pipeta vazio.

3. OPNS Operação

1. Glow-descarregar a película de carbono fina revestida 300 grids EM cobre malha por 10 seg.
2. Pegue uma grade com uma pinça e ligar a pinça para dentro do hangar, mantendo a rede em um 45 ° de inclinação e de 1 polegada acima do gelosuperfície interior da estação de incubação.
3. Dilui-se a amostra de proteína com fosfato de Dulbecco tamponado salino (DBPS) a concentração final de proteína de 0,01 a ~ ~ 0,005 mg / ml. Depósito ~ 4 ul diluída amostra imediatamente após a diluição do lado da grade de carbono de EM. (DPBS pode ser mudado para um outro tampão, se a proteína for sensível a DPBS)
4. Incubar a amostra nas grades EM para ~ 1 min dentro da estação de incubação.
5. Remover o excesso de solução através rapidamente tocar a borda da rede de papel de filtro.
6. Toque a grelha rapidamente para a primeira gota (~ 35 ul) de superfície de água pura em cima da folha de Parafilm direito depois o excesso de solução foi removido da grelha EM. E em seguida, retire o excesso de água rapidamente com papel de filtro.
7. Repita o passo 3.6 para mais duas vezes, lavando a grade EM nas restantes duas gotas de água na Parafilm (Passo 3.6 e 3.7 pode ser ignorada se a amostra é muito sensível à água).
8. Flutuar o gri EMd imediatamente sobre a superfície da primeira gota de UF solução logo após o excesso de água sobre a rede EM foi removido. E então incubar durante 10 seg. Certifique-se para terminar os procedimentos de lavagem de água dentro de 3 segundos antes da grelha flutuante na superfície da solução UF. Quanto mais curto for o tempo de lavagem, o melhor será a qualidade.
9. Limpe as pinças penetrando as dicas em um papel de filtro para ~ 2-3 vezes.
10. Remover o excesso de solução da grelha por meio de contacto da borda de grade com o papel de filtro, e em seguida a grelha flutuar sobre a segunda queda de UF.
11. Continuar acima passo 3.10 do segundo gota.
12. Float a grade no terceiro gota de solução UF e cobrir a estação de coloração para ~ 1 min.
13. Passo opcional: lavar a grelha rapidamente no topo de água, conforme descrito em 3.6. Este passo adicional irá beneficiar amostras contendo mais de partículas de ouro livre carregado ou fundo mancha.
14. Retire o excesso de solução tocando no papel de filtro para potodo e backside grade (lado oposto ao de carbono). Seca-se a grade sob uma ligeira corrente de gás de azoto à temperatura ambiente, depois de observar bem a solução de absorção para o papel de filtro.
15. Coloque a grelha sobre uma folha de papel de filtro no interior de uma caixa de Petri, e cobrir parcialmente a placa com uma tampa para secar pelo menos durante 30 minutos sob temperatura ambiente. Para algumas amostras, coloque a grelha em um 40 ° C incubadora assar por uma hora.
16. Guarde a grade em uma caixa de grade EM para o futuro EM examinando.

4 EM Examinando

1. Alinhe o TEM EM corretamente antes de exame das pequenas proteínas no grid.
   1. Verifique a resolução do mais alto visível Thon-ring que é o espectro de um filme de carbono amorfo poder de determinar se o TEM foi alinhada corretamente. Desde o TEM é compartilhada por muitos usuários diferentes, o TEM foi muitas vezes não devidamente alinhados.
   2. Verifique cuidadosamente o espectro de energia na área de filme de carbono da amostra para ajustar o alinhamento condition da máquina. As maiores visíveis Thon-rings são melhores do que a resolução de destino.
      NOTA: Como um exemplo de um alinhamento adequado de uma MET LaB6 filamento operado sob alta tensão de 120 kV, mais do que 20 Thon-anéis podem ser visualizados, no qual, a resolução correspondente pode ser melhor do que 5,0 Å. Este Thon-anel foi conseguida por transferência de Fourier de uma película de carbono amorfo visualizados sob uma desfocagem de ~ 1,6 ^ m e uma dose de 20,4 electrónico / A2 (Figura 5).
      NOTA: A observação da alta resolução Thon-ring é uma condição necessária, mas não uma condição suficiente para o alinhamento correto. Para conseguir efectivamente as imagens de alta resolução, muitos outros parâmetros são também importantes, tais como a qualidade da amostra, danos de radiação, e que deriva de carregamento, bem como a taxa de dose de iluminação.
2. Traga a desfocagem de volta para quase Scherzer foco para imagens de pequenas proteínas em uma área ideal manchado.
3. Pesquisar por área "nublado" a image. Uma área manchada idealmente está geralmente localizada perto da extremidade de uma área de mancha mais espessa, que se parece com uma área de "turvo" na grelha uma vez que a espessura da mancha é normalmente não uniformemente distribuídos na grelha revestida de carbono (Figura 6). Normalmente, um pequeno aumento (<100x) era ajudar a encontrar essas áreas nubladas antes de zoom in para geração de imagens.

As implementações de OPNS incluem os exames estruturais e morfológicas de várias espécies de lipoproteínas, tais como: HDL nascente recombinante (rHDL), HDL recombinante esférica, o HDL no plasma, colesterol LDL, IDL e VLDL (Figura 2) 30; bem como proteínas tais como pequenas 53 kDa de CETP (entre as proteínas mais pequenas fotografados com sucesso por meio de EM) (Figura 3) 6 e anticorpos IgG 160kDa (uma das proteínas mais dinâmicos e heterogéneos) (Figura 4) 4,5,29,52 , até 28 kDa livre de lípidos apolipoproteína A-1 (Figura 2D), e GroEL e os proteossomas (Figura 2 M e N).

Outros exemplos de OPNS como um método de alto rendimento são examinar interacções proteína-proteína para descobrir os mecanismos da proteína, tais como a 53 kDa de CETP. Como descrito na introdução, como CETP interage com diferentes subclasses de lipoproteínas foram invested via examinando mais de 400 espécimes EM 6 Tanto quanto sabemos, não houve um caso de estudo crio-EM que envolve triagem quase uma centena de condições diferentes.

OPNS pode expandir fronteiras EM estudar pequeno e assimétrico estrutura da proteína em 3D e até mesmo expandir para alcançar estrutura 3D formar um único e individual proteína (sem média). Por exemplo, um anticorpo IgG é 160 kDa molécula com uma estrutura altamente flexível, em que a reconstrução 3D a resolução intermédia é difícil de ser conseguido. o método OPNS foi utilizado para a imagem de um anticorpo IgG a partir de um indivíduo série de ângulos de inclinação (Figura 4E e H). As imagens do OPNS permitiram a reconstrução bem sucedida de uma única proteína por tomografia eletrônica de partícula individual (Ipet) (Figura 4E - J) razoavelmente alta resolução e alto contraste de proteína 4,5. Na reconstrução ipet 3D (Figura 4F e G) 4. Pelo mesmo método, um único complexo de anticorpo-peptídeo foi reconstruído, e o péptido de domínio induzida a mudança conformacional interna de uma única partícula de anticorpo foi descoberto (Figura 4I e J, resolução ~ 16,6 Å) 4,5. Comparando-se as reconstruções 3D de diferentes partículas individuais, a análise estrutural pode permitir-nos para revelar proteínas flutuações termodinâmicas, e até mesmo "snap-shot" os estágios intermediários de uma reação química 4,5,29,53,54.

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Não temos nada a divulgar.