Artigo de método

Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila

DOI:

10.3791/51097

⸱

13 de janeiro de 2014

 ,  , 
1The Visual Systems Group, Division of Pediatric Ophthalmology, Cincinnati Childrens Hospital Medical Center, 2PRESTO, JST

Neste artigo

Resumo

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Recentemente identificamos uma nova produção circadiana Drosophila, ritmo de preferência de temperatura (TPR), em que a temperatura preferida em moscas sobe durante o dia e cai durante a noite. O TPR é regulado independentemente de outra produção circadiana, atividade locomotor. Aqui descrevemos o desenho e análise do TPR em Drosophila.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O relógio circadiano regula muitos aspectos da vida, incluindo sono, atividade locomotor e temperatura corporal (BTR) ritmos1,2. Recentemente identificamos uma nova produção circadiana Drosophila, chamada ritmo de preferência de temperatura (TPR), em que a temperatura preferencial em moscas sobe durante o dia e cai durante a noite 3. Surpreendentemente, a atividade TPR e locomotor são controladas através de neurônios circadianos distintos3. A atividade locomotor de Drosophila é uma produção comportamental circadiana bem conhecida e tem proporcionado fortes contribuições para a descoberta de muitos genes e mecanismos de relógio circadianos conservados4. Portanto, a compreensão do TPR levará à identificação de mecanismos circadianos moleculares e celulares até então desconhecidos. Aqui, descrevemos como executar e analisar o ensaio TPR. Essa técnica não só permite dissecar os mecanismos moleculares e neurais do TPR, mas também fornece novas percepções sobre os mecanismos fundamentais das funções cerebrais que integram diferentes sinais ambientais e regulam comportamentos animais. Além disso, nossos dados publicados recentemente sugerem que a mosca TPR compartilha características com o mamífero BTR3. Drosophila são ectotherms, em que a temperatura corporal é tipicamente regulada comportamentalmente. Portanto, o TPR é uma estratégia usada para gerar uma temperatura corporal rítmica nessas moscas5-8. Acreditamos que uma exploração adicional do Drosophila TPR facilitará a caracterização dos mecanismos subjacentes ao controle da temperatura corporal nos animais.

Introdução

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A temperatura é uma sugestão ambiental onipresente. Os animais apresentam uma variedade de comportamentos para evitar temperaturas prejudiciais e buscar os confortáveis. Drosophila apresentam um comportamento robusto de preferência de temperatura6,7. Quando as moscas são liberadas em um gradiente de temperatura de 18-32 °C, as moscas evitam temperaturas quentes e frias e finalmente escolhem uma temperatura preferencial de 25 °C pela manhã3. Os sensores de temperatura quente são um conjunto de neurônios termossensoriais, neurônios AC, que expressam o potencial do receptor transitório Drosophila (TPR), TRPA16,9. Os sensores de temperatura fria estão localizados nos 3º segmentos de antenas, uma vez que a ablação dos 3º segmentos de antenas causa a falta de evasão de temperatura fria6. Recentemente, foi identificada a proteína TRPP Brivido (Brv)10. Como o Brv é expresso nos 3º segmentos de antenas e media a detecção a frio, o Brv é uma possível molécula de sensoriamento a frio, que é fundamental para o comportamento de preferência de temperatura. Em suma, as moscas usam esses dois sensores de temperatura para evitar as temperaturas quentes e frias e encontrar uma temperatura preferida.

Enquanto os mamíferos geram calor para regular sua temperatura corporal, os ectotherms geralmente adaptam suas temperaturas corporais à temperatura ambiente11. Alguns ectotherms são conhecidos por exibir um comportamento diário de TPR que acredita-se ser uma estratégia para os ectotherms para regular seu BTR12. Para determinar se as moscas apresentavam TPR, repetimos a análise comportamental da preferência de temperatura em vários pontos durante um período de 24 horas. Descobrimos que a Drosophila exibe um TPR diário, que é baixo pela manhã e alto à noite e segue um padrão semelhante ao do BTR em humanos13.

Em Drosophila,há ~150 neurônios de relógio no cérebro. Os neurônios do relógio que regulam a atividade locomotor são chamados osciladores M e E. No entanto, curiosamente, os osciladores M e E não regulam tpr, em vez disso, mostramos que os neurônios do relógio DN2 no cérebro regulam a atividade TPR, mas não locomotor. Esses dados indicam que o TPR é regulado independentemente da atividade locomotor. Notavelmente, o BTR mamífero também é regulado independentemente da atividade locomotor. Estudos de ablação em ratos mostram que o BTR é controlado através de neurônios SCN específicos que visam um subconjunto diferente de neurônios de zona subparaventricular do que aqueles que controlam a atividade locomotor14. Portanto, nossos dados consideram a possibilidade de que o MPI mamífero e a mosca TPR sejam evolucionariamente conservados3, uma vez que tanto a mosca TPR quanto a MMH de mamíferos exibem ritmos de temperatura circadianos dependentes do relógio, que são regulados independentemente da atividade locomotor.

Aqui, descrevemos os detalhes de como analisar o ensaio comportamental do TPR em Drosophila. Este método permite a investigação não apenas do mecanismo molecular e circuitos neurais do TPR, mas também de como o cérebro integra diferentes pistas ambientais e relógios biológicos internos.

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Protocolo

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1. Preparação de Moscas

  1. Experimentos de Luz Escura (LD)
    1. Levante moscas em incubadoras (25 °C/40-60% umidade relativa (RH)) sob ciclos leves de 12 horas/escuros de 12 horas (LD). A intensidade de luz das incubadoras é de ~500-1.000 lux.
    2. Duas incubadoras são necessárias para completar os ensaios comportamentais durante um período de 24 horas. Ambas as incubadoras devem ter uma luz programável com funções ON OFF. Eles também devem ter portas sólidas que não são permeáveis à luz (ou seja, sem vidro ou plexiglass).
      Nota: Uma incubadora deve ser designada como incubadora "day" e definida para um ciclo LD de 12 horas de luz e 12 horas escuras. A segunda incubadora deve ser designada como incubadora "noturna" e definida para o inverso do primeiro com 12 horas de ano, seguida de 12 horas de luz. A incubadora noturna deve ser colocada no quarto acessível no escuro, de tal forma que moscas que experimentam condições noturnas podem ser facilmente acessadas para os experimentos.
    3. Coloque os frascos de mosca em incubadoras dia ou noite. Colete moscas recém-eclodidas em um frasco fresco, 20-30 por ensaio e mantenha na mesma incubadora por 2-3 dias.
    4. Após 2-3 dias, use moscas para o ensaio comportamental de preferência de temperatura.
      1. Para experimentos diurnos (hora de Zeitgeber (ZT) 0-12), colete moscas da incubadora do dia.
      2. Logo antes dos experimentos comportamentais, tire os frascos de mosca coletados da incubadora do dia.
      3. Para experimentos noturnos (ZT 13-24), colete moscas da incubadora noturna.
      4. Logo antes dos experimentos comportamentais, tire os frascos de mosca coletados da incubadora noturna, enrole com papel alumínio e coloque em uma caixa na sala escura sob uma lâmpada vermelha.
        Nota: Uma vez que o ensaio comportamental de preferência de temperatura é realizado sob a escuridão para os experimentos noturnos, a exposição à luz às moscas deve ser evitada até o final dos experimentos comportamentais.
        Nota: As moscas não devem ser expostas ao dióxido de carbono no dia em que os experimentos ocorrerão.
  2. Experimentos de Escuridão Constante (DD)
    1. Dia DD
      1. Uma incubadora extra é necessária para experimentos do dia DD, que chamamos de incubadora de "transição" para o resto do manuscrito. A incubadora de transição deve ser colocada na sala acessível no escuro, de tal forma que moscas que experimentam condições dD podem ser facilmente acessadas para os experimentos. Um exemplo de cronograma de luz para uma incubadora de transição teria a luz ACESA das 13:00 às 19:00 e a luz OFF às 19:00 às 13:00(Figura 1).
      2. Recolhe as moscas que foram levantadas na incubadora do dia. Coloque os frascos de mosca na incubadora de transição entre 13h e 19h, quando a luz estiver acesa. Desta forma, as moscas ficam devidamente expostas à luz até às 19h, momento em que a luz se desliga.
      3. No dia seguinte, antes das 13h, em condições escuras, tire os frascos de mosca da incubadora de transição, enrole-os com papel alumínio e coloque-os em uma caixa. Mantenha a caixa em qualquer incubadora por mais um dia.
    2. Noite DD
      1. Colete as moscas que foram levantadas na incubadora noturna no escuro sob uma lâmpada vermelha. Ou, adicionalmente, coletar as moscas quando a luz da incubadora noturna estiver acesa.
      2. Enrole os frascos coletados com papel alumínio no escuro sempre que as luzes estiverem desligadas e coloque os frascos em uma caixa. Mantenha a caixa em qualquer incubadora por mais dois dias(Figura 1B).
        Nota: Uma vez que o ensaio comportamental de preferência de temperatura é realizado sob a escuridão para os experimentos noturnos, a exposição à luz às moscas deve ser evitada até o final dos experimentos comportamentais.
  3. Experimentos de Luz Constante (LL)
    1. Dia LL
      1. Uma incubadora extra é necessária para experimentos diários ll. Esta incubadora mantém a condição LL (25 °C, 800 lux), com a luz ACESA continuamente.
      2. Recolher moscas que foram levantadas na incubadora do dia. Coloque os frascos de mosca na incubadora LL a qualquer momento durante seu "dia".
    2. Noite LL
      1. Recolher moscas que foram criadas na incubadora noturna. Transfira os frascos de mosca da incubadora noturna para a incubadora LL durante o tempo em que a luz na incubadora noturna estiver acesa.
        Nota: Por exemplo, a luz se apaga às 7h da manhã na incubadora noturna. Transfira os frascos de mosca da incubadora noturna para a incubadora LL antes das 7h e mantenha os frascos na incubadora LL por mais 4 dias.
        Nota: No dia 4 em condições de LL, a oscilação da atividade locomotor é abolida15,16, enquanto o TPR ainda é sustentado 3.

2. O aparelho para o ensaio comportamental de preferência de temperatura

  1. Coloque uma tampa de plexiglass (29 cm x 19,2 cm)(Figura 4) em uma placa de alumínio.
  2. Monitore a temperatura do ar entre a placa e a tampa. Seis sondas de temperatura são anexadas em várias posições no interior da tampa dentro de uma das pistas(Figura 2).
    Nota: Certifique-se de que as sondas não toquem na placa de alumínio ou na tampa do plexiglass. A temperatura do ar deve ser definida para um gradiente de 18-32 °C.
  3. Coloque o aparelho em uma sala ambiental mantida em 25 °C/65-75% RH. Esta sala precisa ser selada de qualquer luz externa. Uma sala ambiental é normalmente equipada com ventiladores para manter uma certa temperatura e umidade.
    Nota: O ar do ventilador provavelmente perturba um gradiente de temperatura estável no aparelho. Para evitar isso, utilizamos uma folha transparente que cobre a área ao redor do aparelho.
  4. Prepare um termômetro e higrômetro para verificar a temperatura e a umidade na sala ambiental.
    Nota: A luz influencia a preferência de temperatura de Drosophila3. A mesma intensidade de luz deve ser fornecida no aparelho uniformemente. A intensidade das luzes da nossa sala ambiental é de ~800 lux.
    Nota: Quando os experimentos comportamentais forem feitos, coloque um tubo conectado do tanque de CO2 ou forneça perto do orifício da parte superior do aparelho, a fim de anestesiar e se livrar das moscas.

3. Preparação de aparelhos para uso

  1. Ligue o aparelho por pelo menos 30 minutos para estabelecer o gradiente de temperatura corretamente na superfície da placa(Figura 3).
  2. Cubra o aparelho comportamental com repelente de água para evitar que as moscas subam as paredes ou o teto da tampa. Limpe o repelente de água em excesso e deixe a tampa por 25-30 minutos para secar.
  3. Remova qualquer condensação na placa de alumínio. Coloque a tampa do plexiglass na placa de alumínio e fixe com seis grampos C(Figura 2).
    Nota: É muito importante que a tampa esteja bem selada, se necessário, pode ser usada fita adesiva dupla.
  4. Deixe a capa por pelo menos 15 minutos. O gradiente da temperatura do ar entre a placa de alumínio e a tampa é criado de 18-32 °C.

4. Ensaio de comportamento de preferência de temperatura

  1. Carregue as moscas no espaço entre a placa de alumínio e a tampa do plexiglass do aparelho através de pequenos orifícios no centro de cada faixa da tampa (Figuras 2 e 4). Cubra os orifícios com deslizamentos de cobertura para evitar que as moscas escapem.
  2. Para as condições escuras, desligue todas as luzes da sala ambiental. Uma lâmpada vermelha pode ser usada quando as moscas são colocadas no aparelho. Certifique-se de que as moscas não estão expostas a nenhuma luz, exceto uma lâmpada vermelha até que os experimentos comportamentais estejam prontos.
  3. Para cada teste, use 20-25 moscas adultas, que não devem ser reutilizadas em testes subsequentes. O ensaio comportamental é realizado por 30 minutos. Tire algumas fotos com ou sem um flash. Tenha cuidado para não fazer muito barulho ou qualquer movimento repentino durante os experimentos.
  4. Regissuas temperaturas de todas as seis sondas no aparelho. Tome nota da temperatura ambiente, bem como da umidade.
  5. Anestesiar as moscas do aparelho com gás carbônico, soltar os grampos, remover a tampa do plexiglass e remover as moscas da placa. Após cada experimento, as moscas são descartadas. Limpe qualquer condensação ou umidade da placa. Substitua a tampa da placa e aperte com os grampos em preparação para o próximo experimento.
  6. Para ter uma representação da preferência de temperatura durante todo o dia, o período de 24 horas é dividido em oito fusos horários, quatro durante o dia e quatro à noite. Por exemplo, usamos estes ZT ou CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 e 22-24.
    Nota: Uma vez que as variações do fenótipo causadas pelos efeitos de mascaramento são esperadas logo após a luz ser acesa (ZT0) ou OFF (ZT12), não examinamos o comportamento de preferência de temperatura durante esses tempos (ZT ou CT 0-1, 11.5-13 e 23,5-24). Pelo menos cinco ensaios devem ser feitos em cada fuso horário para que os resultados sejam estatisticamente sólidos.

5. Análise de dados

  1. Calcule o gradiente de temperatura da seguinte forma: Determine onde as sondas de temperatura são colocadas com base nas duas réguas que são colocadas na parte superior e inferior da tampa do plexiglass ao longo das bordas(Figura 2A).
  2. Estima-se que o gradiente de temperatura entre as sondas de temperatura seja linear. Com base nos locais das sondas de temperatura, bem como em suas temperaturas registradas correspondentes, desenhe linhas representando cada grau de temperatura na posição apropriada nas imagens. Conte o número de moscas localizadas em cada intervalo de grau. Exclua as moscas nas paredes ou no teto da tampa.
  3. Calcule a porcentagem das moscas em cada faixa de temperatura de cada pista. Uma temperatura preferencial média é calculada somando os produtos da porcentagem de moscas e temperatura de cada intervalo, como mostrado abaixo:
    % das moscas x 18,5 °C + % das moscas x 19,5 °C + % das moscas x 20,5 °C ....+ % das moscas x 31,5 °C + % das moscas x 32,5 °C.
  4. Calcule a temperatura preferencial média em cada fuso horário: O comportamento de preferência de temperatura é realizado >5 vezes durante cada fuso horário (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 e 22-24). Para calcular a temperatura média preferencial em cada fuso horário, a temperatura média preferencial de cada ensaio é média em conjunto. As barras de erro s.e.m. são iguais ao erro entre as tentativas.

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Resultados

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Um exemplo do ritmo de preferência de temperatura é mostrado na Figura 5. Se o procedimento de comportamento for feito com sucesso, as moscas devem exibir um TPR no qual preferem uma temperatura baixa pela manhã e temperatura mais alta à noite. O aumento ~1-1,5 °C durante o dia na preferência de temperatura deve ser observado durante o dia, independentemente do fundo genético, uma vez que mostramos que as moscas w1118, yw e Canton S exibem uma preferência de temperat...

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Discussão

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Aqui, ilustramos os detalhes do aparato comportamental de preferência de temperatura e análise do comportamento do TPR. Drosophila exibe as características salientes, robustas e reprodutíveis do TPR controlado pelo relógio. No entanto, nossos dados sugerem que pelo menos dois fatores, luz ambiente e idade, perturbam significativamente os fenótipos comportamentais do TPR.

Observamos que a luz afeta significativamente a preferência de temperatura em Drosophila. É consistente co...

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Divulgações

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Não há nada para revelar.

Agradecimentos

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Somos gratos aos Drs. Aravinthan Samuel e Marc Gershow que ajudaram a desenvolver a versão inicial do aparelho comportamental e Matthew Batie que modificou o aparelho comportamental. Esta pesquisa foi apoiada pelo Trustee Grant do Hospital Infantil de Cincinnati, JST/PRESTO, March of Dimes e NIH R01 GM107582 a F.N.H.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bright Lab Jr. SafelightAmazon#B00013J8UYLuz vermelha para salas escuras
Rain XSOPUSRepelente à água: Aplique a tampa de plexiglass
C-ClampHome Depot
Temperatura/higrômetroFisher15-077-963
Dispositivos PeltierTE Technology, Inc.HP-127-1.4-1.15-71P
TermômetroFlukeFluke 52II
Controlador de bancadaOven Industries5R6-570-15R e 5R6-570-24R
Sonda do sensor de temperaturaOven IndustriesTR67-32
Fonte de alimentaçãosistema de refrigeração do computador
MCR220-QP-RES Radiador duplo de 120 mm com reservatório Sistema de refrigeração do computadorSwiftech
MCP350 Bomba em linha de 12V DCSistema de refrigeração do computadorSwiftech
Placa gráfica MCW50 refrigerador líquidode refrigeração do computadorSwiftech
Ventilador de SY1225SL12SH Scythe Kaze-Jyunide refrigeração do computadorCrazy PC
Produtos ATX genérica de 480 Watts Sistema Sistema

Referências

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