Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas

Resumo

Um método baseado em proteína fluorescente de células vivas para iluminar vacúolos celulares (inclusões) contendo clamídia é descrito. Essa estratégia permite a determinação rápida e automatizada da infectividade da clamídia em amostras e pode ser usada para investigar quantitativamente a dinâmica de crescimento da inclusão.

Resumo

A bactéria intracelular obrigatória Chlamydia provoca um grande fardo para a saúde pública global. C. trachomatis é a principal causa bacteriana de infecção sexualmente transmissível e também a principal causa de cegueira evitável no mundo. Um determinante essencial para a infecção bem-sucedida de células hospedeiras por clamídia é a capacidade da bactéria de manipular a sinalização da célula hospedeira de dentro de um novo compartimento vacuolar chamado inclusão. De dentro da inclusão, a clamídia adquire os nutrientes necessários para seu crescimento de desenvolvimento de 2-3 dias e, além disso, secreta um painel de proteínas efetoras na face citosólica da membrana do vacúolo e no citosol do hospedeiro. Lacunas em nossa compreensão da biologia da clamídia, no entanto, apresentam desafios significativos para visualizar e analisar esse compartimento intracelular. Recentemente, foi descrita uma estratégia de imagem reversa para visualizar a inclusão usando células hospedeiras que expressam GFP. Essa abordagem explora racionalmente a impermeabilidade intrínseca da membrana de inclusão a moléculas grandes, como GFP. Neste trabalho, descrevemos como as células hospedeiras que expressam GFP ou mCherry são geradas para visualização subsequente de inclusões de clamídia. Além disso, este método demonstrou substituir efetivamente os dispendiosos métodos de enumeração baseados em anticorpos, pode ser usado em conjunto com outros rótulos fluorescentes, como a clamídia que expressa GFP, e pode ser explorado para derivar dados quantitativos importantes sobre o crescimento da membrana de inclusão de uma variedade de espécies e cepas de clamídia.

Introdução

Doenças infecciosas causadas por espécies da bactéria intracelular Chlamydia provocar um grande fardo para a saúde global, incluindo doença sexualmente transmissível, doença inflamatória pélvica, cegueira, pneumonia e possivelmente aterosclerose ^1-4. A capacidade de Chlamydia para interagir com a célula hospedeira, a partir de dentro de um vacúolo (denominado a inclusão), constitui um factor determinante para a sua infecção bem sucedida de células e o hospedeiro. A inclusão de um compartimento é patogénico romance que permite o crescimento e clamídia é dinamicamente modificada ao longo de todo o ciclo de desenvolvimento de 2-3 dias de....

Protocolo

1. Geração de linhas celulares hospedeiras fluorescente

1. Dia 1. Placa células 293T (ou outra linha de empacotamento retroviral) em placas de 6 poços a 2 x 10 ⁶ células / poço, para ser ~ 75% confluentes no dia seguinte. Se desejado, placa de poços duplicados para cada um retrovírus para ser utilizado.
2. Dia 2. células Aspirar e adicionar 2 ml de meio de crescimento fresco (DMEM + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamina). Transfectar células com 5-8 ug de cada vector retroviral (contendo GFP) e vector de embalagem (por exemplo., PVSVg) usando Lipofectamine 2000 ou reagente semelhante, e seguindo as instruções do fabricante.
3. Inc....

Resultados

As células de mamífero que expressam as proteínas citosólicas fluorescentes (por exemplo, GFP) pode ser modificado para permitir a iluminação de inclusões de clamídia em células infectadas, culturas vivas. Após a infecção com clamídia, as inclusões são facilmente visíveis como pontos negros nas células hospedeiras (Figura 1). A clareza das inclusões-falta de fluorescência pode ser explorada para a identificação automática de inclusões em numerosos campos de visão e / ou tratam.......

Discussão

Aqui nós descrevemos a estratégia experimental para a geração de células hospedeiras fluorescentes para visualização em tempo real e análise de inclusões de clamídia. Esta abordagem visualização vacúolo confere a poderosa capacidade de iluminar, controlar e medir quantitativamente as propriedades dinâmicas de inclusões por clamídia entre as populações de células ou em células isoladas ao longo do tempo. Inclusões de clamídia em células proteína marcada fluorescentes são notavelmente bem definido, de ta.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µ m filtros	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 sem vermelho de fenol	Cellgro	17-105-CV
Penicilina G	Sigma	13752
Cicloheximida	Sigma	C7698
Pratos de fundo de vidro	MatTek	P35G-1.5-14-C
Lâminas de câmara, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534