Descreve-se um método para marcar a proteína na superfície de neurónios vivos utilizando um anticorpo policlonal específico para epitopos extracelulares. A proteína ligada pelo anticorpo na superfície da célula e subsequentemente internalizados através de endocitose podem ser distinguidas a partir de proteína restante na, ou vendidas para, a superfície durante a incubação.
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Artigo de método
Rotulagem diferencial de superfície celular e internalizado Proteínas após Anticorpo Alimentação da Vivo Cultivadas neurônios
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fim de demonstrar a localização da superfície da célula de um receptor transmembranar putativo em neurónios em cultura, que marcado a proteína na superfície dos neurónios vivos com um anticorpo primário específico criado contra uma porção extracelular da proteína. Dado que os receptores são de tráfico de e para a superfície, se as células são permeabilizadas após a fixação, em seguida, tanto na superfície celular e da proteína interna irá ser detectada pelo mesmo anticorpo secundário marcado. Aqui, nós adaptamos um método utilizado para estudar o tráfico de proteína ("alimentação anticorpo") para a proteína diferencialmente etiqueta que tinham sido internalizados por endocitose, durante o passo de incubação de anticorpo e proteína que permaneceu sobre a superfície da célula ou se tráfico à superfície durante este período . A capacidade de distinguir estas duas piscinas de proteína tornou-se possível através da incorporação de um passo de bloqueio durante a noite com anticorpo secundário sem rótulo altamente concentrada após um incubatio inicialn de neurónios unpermeabilized com um anticorpo secundário marcado por fluorescência-. Após o bloqueio de fase, a permeabilização dos neurónios permitiram a detecção da piscina internalizado com um anticorpo secundário fluorescente marcada com um fluoróforo diferente. Usando esta técnica nós fomos capazes de obter informações importantes sobre a localização subcelular deste receptor putativo, revelando que ele era, de fato, traficadas para a superfície celular em neurônios a. Esta técnica é amplamente aplicável a uma variedade de tipos de células e proteínas da superfície celular, proporcionando um anticorpo adequado para um epitopo extracelular está disponível.
Introdução
Ao estabelecer a função das proteínas recém-identificadas, a investigação da localização subcelular e do tráfico da proteína em questão pode fornecer pistas importantes sobre o provável papel / s de 1,2 proteína. Análise bioinformática do transcriptoma do neocórtex desenvolver 3 nos forneceu uma lista de genes que apresentam expressão alterada durante rato corticogenesis cérebro. Em seguida, adoptou uma abordagem gene knockout para determinar que a proteína codificada por um destes genes, sez6, tem um papel chave no desenvolvimento neuronal. Observou-se que o gene relacionado com Apreensão 6, ou Sez6, proteína está localizado em dendrit....
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Protocolo
1. Dissociated Hippocampal Neuron Cultura
- Prepare lamelas (vidro borosilicato):
- Lavar com 100% de etanol.
- Ar seco sob irradiação UV.
- Revestimento com poli-D-lisina (0,5 mg / ml em tampão de borato de 0,15 M, durante a noite a 4 ° C).
- No dia seguinte (dia de cultura) lavar 3x em PBS, em seguida, o revestimento com laminina (2,5 ug / ml, rato natural, laminina) + 5% v / v de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (FCS) diluído em PBS durante 2 horas a 37 ° C.
- Dissecar embrionárias dia 18 (E18) hipocampo de ratos e recolher em PBS contendo cálcio e magnésio, arrefecidas em gelo. Nota: Todos os pro....
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Resultados
A dupla cor técnica imunocoloração fluorescente aqui apresentado é útil para a marcação de domínios extracelulares de proteínas transmembranares, em células vivas (mostrado esquematicamente na Figura 1). Durante o período de incubação, as imunoglobulinas ligam epítopos acessíveis e uma parte da população das moléculas de proteína, juntamente com o anticorpo ligado, é sujeita a endocitose. Além disso, a proteína sintetizada pode atingir a superfície da célula através de tráfico para a frente e as molécul.......
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Discussão
A técnica aqui descrita é complementar à da biotinilação da superfície celular (revisto por Arancibia-CARCAMO et al.) 12 e é o método de escolha para preservar a informação sobre a localização subcelular da proteína internalizado, proporcionado um anticorpo primário adequado para uma epitopo extracelular está disponível. Em adição, a quantificação de proteína tráfico / internalização ao longo do tempo pode ser realizada (por lamelas, que fixa em diferentes momentos ao longo da incubação de células vi.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem Teele Palumaa para a assistência com os números. Financiado pelo Projeto Grant 1008046 do National Health and Medical Research Council, na Austrália.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| PBS com Ca e Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| meio neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |
| Suplemento B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamina | Invitrogen | 25030-081 | |
| Sistema de Dissociação de Papaína | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Soro Bovino Albumina | Sigma Aldrich Austrália | A9418 | |
| Hank' s solução salina balanceada sem cálcio, magnésio, vermelho de fenol | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Laminina de camundongo natural | Invitrogen | 23017-015 | Descongele no gelo antes de fazer alíquotas Soro |
| bovino fetal HyClone | Thermo Fisher | ||
| Fluorodesoxiuridina | Sigma Aldrich Austrália | F0503 | |
| Uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm Round glass coverwashs | Menzel Glä ser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD meio de montagem aquoso | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| Fragmento Fab AffiniPure Anti-Coelho de Cabra 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldeído | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TÓXICO - cabo na capela de fumaça |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexa Fluor 488-conjugado anti-coelho 2° anticorpo | Invitrogen - Sondas Moleculares | A21206 |
Referências
- Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
- von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (....
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Reimpressões e permissões
