Ecografia-guiada injeção intracardíaca para desenvolver um modelo do rato de mama metástases do cancro cerebral Seguido por Longitudinal MRI

Resumo

Um modelo do rato de mama câncer no cérebro metástase é estabelecida com ultra-som guiada por imagem injeção intracardíaca de células MDA-MB231/Br-GFP. Desenvolvimento de metástases intracranianas multifocais tem sido monitorada longitudinalmente usando alta resolução de 9.4 T MRI.

Resumo

Metástases cerebrais de câncer de mama, que ocorre em 30% dos pacientes com câncer de mama em estágio IV, está associada com alta mortalidade. A sobrevida média é de apenas 6 meses. É crítico para ter modelos animais adequados para imitar a propagação hemodinâmico das células metastáticas no cenário clínico. Aqui, estamos introduzindo o uso de ultra-sonografia pequeno animal para guiar uma injeção precisa do cérebro células de câncer de mama tropical para o ventrículo esquerdo de ratos pelados atímicos. RM longitudinal é usado para avaliar a iniciação intracraniana e crescimento de metástases cerebrais. Injeção intracardíaca de ultra-som-guiada garante não só uma injeção precisa e vem uma taxa de sucesso mais elevada, mas também diminuiu significativamente a taxa de mortalidade, em comparação com o nosso procedimento manual anterior. In vivo alta resolução de ressonância magnética permite a visualização de lesões multifocais hiperintensas, tão pequeno quanto 310 mM de diâmetro em T imagens _2-ponderadas em 3 semanas após a injecção. Follow-se a RM revela crescimento do tumor intracraniano e aumento do número de metástases que distribuem ao longo de todo o cérebro.

Introdução

Metástase cerebral é a doença maligna intracraniana mais comum em adultos. O prognóstico é extremamente pobre, com uma sobrevida média de 4-6 meses, mesmo com o tratamento agressivo. O câncer de mama é um dos três principais tipos de câncer primário com alta morbidade da metástase cerebral ^1-3. Várias linhas de câncer de mama cérebro-trópicos são capazes de desenvolver metástases cerebrais após intracardíaca ou injeção intracarotídeo ^4. Injeção direta de células tumorais para o ventrículo esquerdo pode ignorar o leito capilar pulmonar e, assim, aumentar a incidência de formação de metástases cerebrais, minimizando metástases viscerais. A linha MDA-MB231Br é uma das linhas de cancro da mama humanas mais utilizados para desenvolver metástase cerebral em modelos de roedores ^5,6.

Como muitos outros estudos ^4,7, temos realizado um procedimento manual de injeção intracardíaca em nossos estudos anteriores. No entanto, apenas 50% taxa de sucesso foi obtido com o manualinjecção e uma fracção de ratinhos morreram devido aos procedimentos invasivos repetidos se os ensaios anteriores falharam. Aqui, estamos introduzindo o uso de um procedimento guiado por imagem para garantir a injeção de células de câncer de mama em busca do cérebro para o ventrículo esquerdo do rato atímico. Longitudinal alta resolução de ressonância magnética é aplicada a acompanhar o desenvolvimento intracraniana de metástases cerebrais.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de University of Texas Southwestern Medical Center Animal Care Institucional e uso.

1. Preparação das Células MDA-MB231/Br-GFP

1. Recuperar e cultura das células MDA-MB231/Br-GFP (gentilmente cedidas pelos Drs. Palmieri e Steeg, NCI) em meio DMEM contendo 10% de FBS, 1% de glutamina e 1% de penicilina / estreptomicina.
2. Observar o estado das células e cor de meio, e substituir meio cada 2-3 dias.
3. Tripsinizar e recolher as células, quando 80% de confluência é alcançado como descrito nas etapas 1.3.1-1.3.5:
   1. Remover o meio antigo por completo e adicione 5 ml de PBS (1x) para lavar as células suavemente. Remover o PBS a partir do prato.
   2. Adicionar 1,5 ml de tripsina no prato; inclinar o prato suavemente para assegurar que todas as células são cobertas por tripsina. Coloque o prato de volta na incubadora celular e mantê-la a 37 ° C durante 1 min.
   3. Leve o prato de incubadora e observaras células em microscópio óptico para assegurar que as células separar do prato.
   4. Adicionar 3 ml de meio para parar o efeito de tripsina. Recolhe-se a mistura de células num tubo de centrífuga. Centrifugar a mistura a 2000 rpm durante 5 min.
   5. Retire cuidadosamente o meio e ressuspender as células em 5 ml de soro meio livre até ficar homogéneo.
4. Contar o número apropriado de células e ressuspender-los em meio DMEM isento de soro com uma concentração final de 1,75 x 10 ⁵ células em 100 uL de volume.
   1. Tome 50 mistura de células mL e adicionar 50 ul Trypan Blue. Após a mistura, levar de 10 mL mistura e adicione cuidadosamente para o slide contagem das células. Use várias amostras para garantir a estimativa do número de células precisa.
   2. Fique no slide contagem de células, uma extremidade de cada vez eo contador de células começa a contar automaticamente. Tome média de todos os resultados de contagem e calcular o número total de células.
   3. Centrifugar as células novamente e ressuspender-los emo volume apropriado de meio isento de soro para resultar na concentração final de 1,75 x 10 ⁵ células/100 uL de volume.
5. Colocar as células em gelo antes da injecção intracardíaca.

2. Ecografia-guiada injeção intracardíaca

1. Use camundongos nu feminino (BALB / c nu / nu) entre 6-8 semanas de idade.
2. Entrar no sistema de imagem. Inicializar o transdutor 704 (40 MHz).
3. Iniciar um novo estudo e preencher as informações.
4. Anestesiar (3% isoflurane/100% O ₂ em uma câmara de indução) e manter os animais com isofluorano (2%) em 100% _de O2 (1 dm ³ / min) durante todo o processo por meio de um cone de nariz. A anestesia é confirmado quando há reflexo de retirada é observado com toe pitada.
5. Regule a temperatura da tabela de imagem de 37 ° C. Tape o rato anestesiado com a tabela de imagem aquecido em posição supina.
6. Manter o gel de ultra-sons a 37 ° C antes de imenvelhecimento. Aplique o gel para o peito do mouse.
7. Monte o transdutor no suporte. Diminuir o transdutor até a profundidade da imagem desejada seja atingida. Mover a etapa até que o ventrículo esquerdo é identificado com a aorta ascendente, como o ponto de referência (Figura 1A). Bloquear o estágio em que uma visão clara do ventrículo esquerdo é visualizado.
8. Desenhar 100 ul de mistura de células para uma seringa de 1 ml com uma agulha G 22. Coloque e fixar a seringa na seringa de montagem.
9. Mova a seringa para a frente em direção ao peito do mouse e mova-o com cuidado lado para o outro até que a ponta da agulha está no campo de imagem de visão (antes de entrar no mouse).
10. Ajuste a altura da agulha e ângulo para apontar para baixo do ventrículo esquerdo.
11. Penetrar a agulha da seringa no espaço intercostal prontamente através de camadas da pele e do músculo para o ventrículo esquerdo, sob a orientação de ultra-sonografia.
    Uma indicação de uma inserção bem sucedida da agulha no interior do ventrículo esquerdocle é o refluxo do sangue arterial fresco (cor-de-rosa, em contraste com o sangue venoso vermelho escuro) com a seringa
12. Injectar a mistura de células lentamente (Figura 1B).
13. Após a conclusão, retirar a agulha, levante o transdutor, limpe o gel de ultra-som com gaze umedecida e remova a fita.
14. Prepare uma gaiola limpa com um bloco pré-aquecido.
15. Colocar o animal na almofada e observar o animal até a recuperação total.
16. Monitorar o comportamento do animal a cada 24 horas, por dois dias.
17. Condições gerais e sinais neurológicos de complicações em ratinhos experimentais são rotineiramente monitorados.

3. Monitoramento MRI de desenvolvimento do tumor intracraniano

1. Use um ímã 9,4 Tesla para monitorar o desenvolvimento intracraniana de metástases cerebrais.
2. Iniciado MRI duas semanas após a implantação do tumor e repita uma vez por semana por até três semanas.
3. Sedar os animais com 3% de isoflurano e mantê-los sob geneanestesia geral (1,5% de isoflurano).
4. Monitorar e manter a temperatura do corpo do animal e constante da respiração durante todo o experimento.
5. Multislice de alta resolução (14 fatias com 1 mm de espessura, sem intervalo) T ₁ - T ₂ e ponderada imagens coronais, que abrange a região do lobo frontal para a fossa posterior, são adquiridos com os seguintes parâmetros: _1-T imagens ponderadas: girar eco fatia múltipla (SEMS), TR / TE = 400 ms msec/20, matriz: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, na resolução do plano: 78 x 78 mM ^2. T imagens _2-ponderada: rotação rápida eco fatia múltipla (FSEMS) seqüências, TR / TE = 2500 msec/48 ms, 8 trens eco, matriz: 256 x 256, FOV 20 x 20 mm, na resolução do plano: 78 x 78 ^ M ^28,9.
   Lesões tumorais parecem mais brilhantes do que os tecidos normais do cérebro em t imagens _{2-ponderados.}
6. O tamanho do tumor é determinado em t imagens _2-ponderados por delinear manualmente o acesciamento porção da massa em cada imagem usando programas MATLAB escritos por nós ^8.
   Dado a maior parte do tumor diâmetros são menores do que a espessura da fatia (1 mm), o tamanho do tumor apresenta-se como na área do plano, em vez de o volume.

4. H & E coloração Confirmando as metástases

1. Sacrificar os ratos imediatamente após a última MR varredura, dissecar os cérebros portadores de tumor e incorporá-lo em meio outubro e congelado em -80 ° C.
2. Seção de uma série de 10 m de espessura cérebro coronal amostras com criostato.
3. Realize H & E coloração nas seções do cérebro.

Resultados

Com a elevada resolução espacial de ressonância magnética (78 mM de resolução do plano), lesões de hiper-intensas podem ser identificados tão pequeno quanto 310 um de diâmetro (Figura 2). Desde as metástases neste estudo são muito pequenos e desenvolvimento de necrose e edema é mínima, a lesão hiperintensas em T imagens _2-ponderados realmente representava a massa tumoral.

Exames de ressonância magnética permitem longitudinais na avaliação não invasiva

Discussão

No presente estudo, demonstramos que a injeção ventricular esquerda guiada por ultra-sonografia garante a precisão de modo que todos os animais do estudo desenvolveram metástases cerebrais e morte do animal não foi observada. A beleza da injeção guiada por imagem é que o caminho da penetração da agulha da pele e, finalmente, para o ventrículo esquerdo pode ser monitorado e ajustado sob a imagem, o que é distinto do procedimento manual que exige rigorosos marcos anatômicos para seguir.

Entend...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
	DMEM HyClone	SH30022.01
Tripsina	Mediatech	25-051-C1
Contador automático de células	BioRad	TC10
Isoflurano	Baxter International Inc.	1001936060
Sistema de Imagem de Alta Resolução VisualSonics Vevo 770	Visual Sonics Inc.
Ímã de furo horizontal de 9,4 T com um sistema Varian INOVA Unity	A Agilent
Composto O.C.T	Sakura Finetek USA	4583