O mais rápido na Cidade Ocidental: um toque contemporâneo na Análise clássico Western Blot

Jillian M. Silva; Martin McMahon

doi:10.3791/51149

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Artigo de método

O mais rápido na Cidade Ocidental: um toque contemporâneo na Análise clássico Western Blot

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DOI:

10.3791/51149

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5 de fevereiro de 2014

Jillian M. Silva¹ , Martin McMahon¹

¹Diller Cancer Research Building, University of California, San Francisco

Neste artigo

Resumo

Este protocolo explora os mais recentes avanços na realização de análises de Western blot. Estas novas modificações empregar um sistema de gel de Bis-Tris com uma electroforese em tempo de execução de 35 minutos, uma seco do sistema de transferência de mancha de 7 min, e a detecção da proteína fluorescente no infravermelho e de imagem que gera uma maior resolução, qualidade, sensibilidade, e precisão melhorada de dados ocidentais.

Resumo

As técnicas de Western blot que foram originalmente estabelecidas no final de 1970 ainda estão ativamente utilizado hoje. No entanto, este método tradicional de transferência Western tem vários inconvenientes que incluem a resolução de baixa qualidade, bandas espúrias, diminuição da sensibilidade, e a integridade da proteína pobre. Os avanços recentes têm melhorado drasticamente inúmeros aspectos do protocolo padrão de Western blot para a produção de dados qualitativos e quantitativos mais elevados. O sistema de gel de Bis-Tris, uma alternativa ao sistema convencional de Laemmli, gera uma melhor separação e resolução de proteínas, mantém a integridade da proteína, e diminui a electroforese para um tempo de corrida de 35 min. Além disso, o sistema de mancha seca iBlot, melhora drasticamente a eficácia e velocidade de transferência da proteína para a membrana em 7 min, o que está em contraste com os métodos de transferência de proteína tradicionais que são muitas vezes mais ineficaz com tempos de transferência longas. Em combinação com estas modificações altamente inovadores, proteínas detection usando resultados de imagem fluorescente infravermelhos em maior qualidade, mais precisos e dados consistentes em comparação com a técnica de Western blot padrão de quimiluminescência. Esta tecnologia pode detectar simultaneamente dois antigénios diferentes sobre a mesma membrana, pela utilização de duas cores de corantes de infravermelho próximo, que são visualizadas em diferentes canais fluorescentes. Além disso, a linearidade e ampla gama dinâmica de imagiologia fluorescente permite a quantificação precisa de bandas de proteínas, tanto fortes e fracos. Assim, este protocolo descreve as principais melhorias para o método de Western blot clássico, em que esses avanços aumentar significativamente a qualidade dos dados, reduzindo consideravelmente o tempo do experimento de desempenho.

Introdução

A técnica de Western blot foi desenvolvido pela primeira vez entre 1977 e 1979, a fim de criar um método melhorado para a detecção de proteínas utilizando anticorpos ^1-3. Este procedimento utilizado transferência electroforética de proteínas para membranas de géis de SDS-PAGE com proteínas alvo visualizadas utilizando anticorpos secundários e detectados por auto-radiografia, a luz UV, ou um produto de reacção de peroxidase ^3. Assim, estes mesmos princípios básicos são ainda largamente utilizados em protocolos actuais de Western blot. No entanto, essa técnica clássica de Western Blot não apresenta muitas desvantagens, tais como tempos lento....