Den hurtigste Western i byen: et moderne twist på den klassiske Western Blot-analyse

Summary

Denne protokol udforsker de seneste fremskridt i udførelsen af ​​Western blot-analyser. Disse nye ændringer ansætte en bis-tris gel-system med en 35 min elektroforese køre tid, en 7 min tør blotting transfer-system, og infrarødt fluorescerende protein detektion og billeddannelse, der genererer højere opløsning, kvalitet, følsomhed og forbedret nøjagtighed vestlige data.

Abstract

Western Blot-teknikker, der oprindeligt blev etableret i slutningen af ​​1970'erne, er stadig aktivt udnyttes i dag. Men denne traditionelle metode med Western blotting har flere ulemper, der omfatter lav kvalitet opløsning, falske bands, nedsat følsomhed, og dårlig protein integritet. Nylige fremskridt har drastisk forbedret mange aspekter af standard Western blot-protokollen til at producere højere kvalitative og kvantitative data. Bis-tris gel-system, et alternativ til den konventionelle Laemmli systemet genererer bedre protein separation og opløsning, vedligeholder protein integritet og reducerer elektroforese til en 35 min køretid. Desuden iBlot tør blotting-systemet, forbedrer dramatisk effekt og hastighed af protein overførsel til membranen i 7 min, hvilket er i modsætning til de traditionelle protein overførselsmetoder, som ofte er ineffektive med lange overførselstider. I kombination med disse meget innovative ændringer, protein detection bruge infrarød fluorescerende billeddannelse resulterer i højere kvalitet, mere præcis og sammenhængende data i forhold til standard Western blotting teknik kemiluminiscens. Denne teknologi kan samtidigt detektere to forskellige antigener på den samme membran ved anvendelse af to-farve nær-infrarøde farvestoffer, der er visualiseret i forskellige fluorescerende kanaler. Desuden linearitet og brede dynamikområde fluorescerende billedbehandling giver mulighed for præcis kvantificering af både stærke og svage protein bands. Således er denne protokol beskriver de vigtigste forbedringer af den klassiske Western blotting metode, hvor disse fremskridt øge kvaliteten af ​​de data, mens høj grad reducerer ydeevnen tid for dette eksperiment.

Introduction

Teknikken med Western blotting blev først udviklet mellem 1977 og 1979 for at skabe en bedre metode til påvisning af proteiner under anvendelse af antistoffer ^1-3. Denne procedure anvendes elektroforetisk overførsel af proteiner til membraner fra SDS-PAGE-geler med målproteiner visualiseret ved hjælp af sekundære antistoffer, og påvist ved autoradiografi, UV-lys eller en peroxidasereaktion produkt ^3. Således er disse samme grundlæggende principper stadig meget udbredt i dagens Western blot protokoller. Men denne klassiske Western blotting teknik frembyder mange ulemper, såsom langsomme elektroforese køre tider, lav opløsning og kunstige protein bands, følsomhed over for protein nedbrydning og begrænset følsomhed samt dårlig datakvalitet ^4. Derfor er denne protokol beskriver betydelige fremskridt og forbedringer til den standard Western blot procedure, der genererer mere præcise kvalitative og kvantitative data.

"> Det Laemmli-system til adskillelse af en bred vifte af proteiner ved brug af SDS-PAGE er den mest udbredte gel system til Western blotting ^5. Trods af populariteten af denne Western blotting-system, kan denne metode resultere i band forvrængning, tab af opløsning, og falske bånd ^4. Dette kan være en konsekvens af deaminering og alkylering af proteiner på grund af den høje pH-værdi (9,5) i separationsgel, reoxidering af nedsatte disulfidbindinger på grund af den varierende redoxtilstand af gelen, og spaltning af aspartyl-prolyl peptidbindinger pga. opvarmning af proteinet i Laemmli-buffer (pH 5,2) ^4,6. bis-tris gelsystem, der opererer på en neutral pH-værdi (7,0), giver betydelige fordele over Lamemmli systemet. Dette system forbedrer protein stabilitet, minimerer protein modifikationer, vedligeholder proteiner i deres reducerede stater, forhindrer aspartyl-prolyl spaltning under elektroforese, og endnu vigtigere, det elektroforese køre tid er 35 min ^4,6,7. Desuden than Bis-Tris gelsystem producerer også skarpere bands, højere opløsning og separation, og øget følsomhed resulterer i mere pålidelige data ^4.

I forbindelse med Bis-Tris-gel system, iBlot tør blotting system bruger høj feltstyrke og strømme til at reducere overførsel tid af proteiner fra geler på membraner inden 7 min ^8. Denne overførsel er baseret på tør blotting metode, der frembringer en mere effektiv og pålidelig overførsel af proteiner ^8. For en detaljeret sammenligning af effekten af iBlot transfersystem til de konventionelle overførselssystemer henvises til følgende websted: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Det udnytter en anode og katode stak, som består af en gelmatrix, der indeholder de relevante transfer buffere, der fungerer som ion reservoirer ^8. Under overførslen vand elektrolyse med til at forhindre dannelsen af ilt fra kobber anode resulterer i en mere ensartet protein overførsel uden at forårsage band forvrængning ^8. Desuden er denne transfersystemet også øger overførselshastigheden ved at reducere afstanden mellem elektroderne ^8.

Selvom kemoluminescens er den mest almindelige og traditionelle teknik for protein detektion af Western blot-analyser, to-farvet infrarødt fluorescerende afsløring forbedrer følsomheden, kvalitet og nøjagtigheden af ​​Western blot data. Denne påvisningsmetode bruger infrarød laser excitation i to optimale bølgelængder, 700 nmog 800 nm for at danne et klart billede af data med den største signal-til-støj-forholdet og højeste følsomhed ^9. Således kan to målproteiner visualiseres samtidigt på den samme membran ved hjælp af 700 nm og 800 nm fluorescerende detektion kanaler. Endnu vigtigere er, linearitet og dynamiske område af infrarød fluorescens giver præcis kvantitativ analyse af både stærke og svage proteinbåndene ^9. Desuden er denne protokol giver enorme fordele og forbedringer i forhold til den klassiske Western blotting teknik ved at mindske elektroforese og overførsel gange af dette eksperiment uden at kompromittere effekten af ​​disse processer og udnytte infrarød fluorescerende protein opdagelse til at producere større kvalitative og kvantitative Western blot data.

Protocol

1.. Fremstilling af helcellelysater fra cellekultur

1. Placer celledyrkningsskåle på is og tilsæt koldt PBS med 5 mM EDTA (fx 5 ml PBS med 5 mM EDTA/10 cm ² plade). Fjern adhærente celler fra skålen ved hjælp af en celleskraber og derefter overføre cellesuspensionen til en kold 15 ml konisk rør.
2. Pelleter cellesuspensioner ved lav hastighed centrifugering ved 1.000 rpm (230 x g) i 5 minutter ved 4 ° C. Placer koniske rør på is og omhyggeligt aspirere supernatanten uden at forstyrre bundfaldet.
3. Vask pelleten med 1 ml PBS med 5 mM EDTA og overføre cellesuspension til en kold 1,5 ml centrifugerør. Hurtig tur suspension ved 13.000 rpm (13.226 xg) i 10 sek til pelletere cellerne. Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pellet og placere rørene på is.
4. Resuspender pellet i 25-200 pi (afhængig pillestørrelse, dvs til 3 x 10 ⁶ celler tilføje ~ 150 pi RIPA-buffer) iRIPA-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 10 mM NaF, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxycholat, 1% NP-40) indeholdende frisk tilsat protease og phosphataseinhibitorer på 2x slutkoncentration. Kort vortex hvert rør og inkuberes suspensionen i 20-30 minutter på is. Bemærk: Der er flere lysis buffere, der kan anvendes til at udvinde proteiner, der afviger i deres evne til at opløse proteiner og styrken af deres denaturerende detergent (dvs. SDS, Triton X-100 eller NP-40). RIPA-buffer er nyttigt til fremstilling af helcellelysater og forstyrrer protein-protein interaktioner.
5. For at oprette en post-nukleare fraktion, centrifuge lysates ved 14.000 rpm (15.339 xg) i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten overføres til et nyt rør uden at forstyrre de nukleare beriget pellet og placere rørene på is. Bemærk: det nukleare beriget pellet kan også løsnes fra røret, mens udvinding supernatanten. For at undgå at indsamle den nukleare beriget pellet, anbringe pipettespidsen direkte into tyktflydende nukleare beriget pellet og tegne det op med pipetten for at bortskaffe det.
6. Bestem proteinkoncentrationer af hver prøve i overensstemmelse med producentens anvisninger under anvendelse af sådanne protein kvantificering assays BCA eller Bradford.

2. Prøveforberedelse og elektroforese

1. Hver prøve Forbered ifølge det følgende skema er skitseret nedenfor. Som et alternativ, kan β-mercaptoethanol også anvendes i en slutkoncentration på 2,5%. Imidlertid bør reduktionsmidlet tilsættes til hver prøve op til en time før ilægning gelen. De samlede mængde svarer til pipettering variationer med kun 20 ul af hver forberedt prøve indlæst pr godt.

   REAGENS	Reducerede prøve
   Protein Sample	X ul
   4x LDS Sample Buffer	6 pi
   500 nM DTT Reducing Agent	2.4 pi
   Demineraliseret vand	Op til 15,6 pi
   Totalvolumen	24 pi

2. Heat prøver ved 70 ° C i 10 min. Mens prøverne er varme, forberede 1.000 ml 1x MES eller MOPS løbebuffer (50 ml 20x MES eller MOPS løbebuffer plus 950 ml deioniseret vand). MOPS Running buffer løser mid-size proteiner mellem 14-200 kDa, mens MES løbebuffer løser mindre molekylvægt proteiner mellem 2-200 kDa med en lavere pKa, som giver MES Running Buffer til at køre hurtigere end de MOPS ^4. Således har disse to buffere kontrasterende virkninger på vandring af ioner i stabelgelen, der fører til forskelle i adskillelsen af proteinbånd ^4. Braklægning og kombinere 200 ml 1x MES eller MOPS Running Buffer med 500 pi antioxidant, som vil blive brugt til at fylde den øverste Buffer Afdeling Mini-Cell elektroforese enhed.
3. Når prøverne er færdig varme, hurtige spin-prøver før placere dem på is.
4. For montering af præfabrikerede Bis-Tris geler til mini-Cell enhed til elektroforese følge producentens anvisninger. Bemærk: Sørg for hver gel er orienteret på en sådan måde, at jo kortere (mindre) kassette af hver gel vender indad mod Buffer Core og geler er niveau og stramt presset mod Buffer Core for at undgå lækage fra Upper bufferkammeret.
5. Fyld Upper bufferkammeret med 200 ml 1x MES eller MOPS løbebuffer indeholder antioxidant og Lower bufferkammeret af Mini-celle enhed med cirka 600 ml 1x MES eller MOPS Running Buffer. De ekstra 200-300 ml løbebuffer kan gemmes til senere brug. Imidlertid er det ikke anbefales at genbruge anvendte puffer under elektroforese køre som pH-værdien og kvaliteten af ​​bufferen kan ændres.
6. Load 20 pi af hvert protein Sample i hver brønd. Hvis sektionering membranen i forskellige strimler for at undersøge for flere antistoffer (dvs. mere end 2), er det stærkt anbefales at indlæse 2-5 ul af prestained protein standard i de første og sidste brønde af hver gel, da dette vil tjene som skæring guider til at adskille de forskellige dele af membranen uden at påvirke billeddannelse af proteinbåndene.
7. Kør geler ved 200 V konstant i 35 minutter med en forventet strøm på 110-125 mA / gel i starten og 70-80 mA pr gel i slutningen. Elektroforese er færdig, når den sporingsfarve migrerer til platintråden langs Buffer Core.

3. Protein Transfer Brug af iBlot Dry Blotting System

1. Helt adskille mini-geler ved at bryde bundne sider af kassetten (kan producere en knitrende støj). Kassér kortere (mindre) plade og omhyggeligt overføre gelen fra længere (slidset plade) i en beholder med deioniseret vand ogfjerne den tykke ben del af gelen placeret nederst. Bemærk: i sjældne tilfælde kan gelen tillægger kortere plade i stedet for den længere, slidset plade. I dette tilfælde, kasseres længere opslidset plade og fjern den tykke ben del af gelen placeret nederst. Derefter forsigtigt overføre gelen fra kortere pladen til deioniseret vand.
2. Saml anode og katode transfer stakke i henhold til producentens anvisninger. Bemærk: både nitrocellulose eller PVDF-membraner levere høj kvalitet og effektiv overførsel af proteiner og er kompatible med fluorescerende detektion ^8. , PVDF-membran har imidlertid en højere bindingskapacitet (240 ug / cm ³⁾ end nitrocellulose (200 ug / cm ^{3) 8.}
3. Fjern forsigtigt eventuelle bobler eller luft fanget mellem gelen og membranen, da dette vil forhindre enhver fordrejning af proteinbåndene under overførslen. Bemærk: Du må ikke trimme membranen eller transfis stak til at passe din gelstørrelse da dette vil medføre direkte kontakt mellem anode og katode stakke.
4. Efter korrekt samle transfer stakke på den tørre blotting enhed, vælge den korrekte spænding programmet (dvs. Program 3: 20 V for 7 min) og begynde overførslen. Bemærk: proteiner større end 150 kDa tendens migrere langsommere og kan kræve en længere overførselstid på 8-10 min. Desuden vil forudgående inkubering af gelen i 20% ethanol i 5-10 minutter også bidrage til at forbedre overførslen effektiviteten af ​​disse store proteiner. Når overførslen program er færdig, vil enheden automatisk slukke for strømmen. Det er bedst at straks at fjerne membranen og fortsætte med blokerende procedure for at sikre en bedre protein opdagelse og undgå udtørring membranen.

4.. Infrarød Fluorescent Protein Detection

1. Blok membran (er) i et minimum af 0,8 ml / cm ² af Odyssey Blocking Buffer (Do Not Tilføj Tween-20) i 1 time ellernatten over ved 4 ° C. Membran (er) kan også blokeres med fedtfri tørmælk, men dette kan medføre højere baggrund og forstyrre protein detektion.
2. Inkuber membranen (r) i den primære antistof ved den ønskede koncentration i Odyssey blokeringsbuffer med 0,1% Tween-20 natten over ved 4 ° C. For to-farve påvisning, hvor to forskellige antigener er visualiseret på samme blot skal de to primære antistoffer afledes fra forskellige værtsart og tilsættes samtidigt til membranen (r). Bemærk: før inkubere membranen (r) i den primære antistof, kan membranen (erne) opdelt i forskellige dele med henblik på at undersøge for flere antistoffer (dvs. mere end 2) på samme membran.
3. Vask membranen (r) 3x i 10 minutter i TBS plus 0,1% Tween-20 med forsigtig rystning.
4. Inkuber membranen (r) med fluorescens-mærkede sekundære antistoffer ved en fortynding på 1:20.000 til 700 nm kanal og 1:6,000-1:10,000 for 800 nm kanal i Odyssey blokeringsbuffer med 0,1% Tween-20 i 30-60 min (inkubere membran (r) i mere end 1 time kan øge baggrunden). Beskyt membran (r) fra lys. Bemærk: de sekundære antistoffer skal udledes af den samme værtsart som hver af de primære antistoffer og mærket med forskellige fluoroforer.
5. Vask membranen (r) 3x i 10 minutter i TBS plus 0,1% Tween-20 med forsigtig rystning. Beskyt membran (r) fra lys.
6. Membran (er) kan være tørret eller gemmes i enten TBS eller PBS uden Tween-20 ved 4 ° C indtil scannes og afbildes med en infrarød Imaging System. Fluorescerende signal vil forblive stabilt i flere måneder, hvis ordentligt beskyttet mod lys.

Representative Results

To-farve infrarød fluorescens registrerer både stærke og svage bånd på den samme membran med forbedret følsomhed og den højeste signal-til-støj-forhold for at producere klare Western blot billeder. Typiske resultater genereret af tofarvede Western blotdetektion visualiseret i både 700 nm og 800 nm fluorescerende kanaler er eksemplificeret i figur 1 og 2.. Den øverste Western blot i Figur 1 viser den samtidige (overlay) påvisning af den samlede ERK1 / 2 med 800 nm kanal (grøn) og β-actin i 700 nm-kanal (rød) af to-fold seriefortyndinger af lysater fra det menneskelige afledt melanom cellelinie WM793. Desuden har denne membran også blevet skåret i sektioner, baseret på molekylvægten af ​​det ønskede protein mål med henblik på at give mulighed for mere end to antistoffer, der skal behandles på samme blot. For eksempel blev analyseret i figur 1 membran skæres i halve for at undersøge den nedre åbningion af membranen med en tredje antistof, total BIM (700 nm kanal-rød), uden at udlede med påvisning af både total ERK1 / 2 og β-actin. Det første panel i figur 2 viser de to-farvede Western blot fluorescerende detektion af fosfor ERK1 / 2 yderligere (800 nm kanal-grøn) og total ERK1 / 2 (700 nm kanal-rød) med overlappende fosfor ERK og total ERK signaler vises i gult af WM793 melanomaceller behandlet i nærvær og fravær af MEK1 / 2-inhibitor, PD0325901 (Meki), som undertrykker ERK1 / 2 MAP-kinase-signalvejen. Endvidere kan 700 nm og 800 nm fluorescerende billeder også omdannes til faste sorte og hvide Western blot-billeder for hver antistof (figur 1 og 2). Generelt vil de fleste af Western blot billeder produceret af denne protokol resultere i billeder af høj kvalitet, som udstillet i figur 1 og 2.. Men afhængigt af selektivitet, specificitetog kvaliteten af ​​det primære antistof, mindre end optimale billeder kan resultere i en lille del af blots analyseret ved denne metode. For eksempel, som observeret i de nederste to paneler af figur 2 afsnit kvaliteten af phospho-BIM-antistof i WM793 melanomceller behandlet med og uden MEK hæmning resulterede i et Western blot-billede med svage proteinbånd og ekstremt høj membran baggrund.

Samtidig infrarødt fluorescerende billeddannelse af to målsætninger kan også give mulighed for kvantitativ analyse af Western blots over et bredt, lineært dynamisk område ved effektivt og nøjagtigt at detektere både stærke og svage bånd på den samme membran. Kvantificering af proteinbånd beregnes som en integreret intensitet, som er proportional med mængden af ​​fluorescensmærkede antistoffer på membranen og er uafhængig af både størrelsen af ​​formen trækkes omkring båndet og opløsning. Dette er baseret på følgende kriterier: 1) eren af formen, 2) antallet af pixels lukkede i form 3) gennemsnitlige intensitet af de udvalgte som baggrund pixels og 4) den samlede intensitet af pixels lukkede i den givne form ¹⁰ Figur 3A viser protein kvantificering af. Western blots illustreret i figur 1.. Kvantificering af total ERK1 / 2, β-actin, og den samlede BIM udviser en lineær sammenhæng mellem en forøgelse af den integrerede intensitet af det fluorescerende signal, og stigningen i proteinkoncentration (figur 3A). Desuden 3B er et andet eksempel på, hvordan at kvantificere protein niveauer fra fluorescerende Western blots, som viser det protein kvantificering af fosfor ERK1 / 2 normaliseret til total ERK1 / 2 protein niveauer af WM793 melanom celler behandlet med og uden MEK hæmning fra figur 2 . Fra denne kvantificering kan de phosphorylerede ERK1 / 2 niveauer beregnes som en procent af kontrol niveauer. I denne CASE, phospho-ERK niveauer af melanomceller behandlet med MEK-inhibitor var 0,6% af kontrollen.

Fig. 1. Western blot-analyse under anvendelse af to-farve infrarødt fluorescerende protein detektion. Lysater af to-fold seriefortyndinger af WM793 human-afledt melanom protein blev separeret under anvendelse af en Novex NuPAGE Bis-Tris-gel med proteiner overført til PVDF-membran under anvendelse iBlot apparat overførslen . Membraner blev blokeret i Odyssey blokeringsbuffer og probet med de følgende primære antistoffer: kanin-anti-total ERK1 / 2, kanin-anti-total BIM og muse-anti-β-actin. Antigen-antistof-komplekser blev detekteret ved anvendelse af fluorescerende gede-anti-kanin IRDye 800 (grøn) eller 680 (rød) og gede-anti-muse IRDye 680 (rød) sekundære antistoffer, henholdsvisog visualiseret med LI-COR Odyssey Classic Infrarød Imaging System. Den første Western blot panel er overlejring af den samtidige påvisning af de samlede ERK1 / 2 (800 nm kanal-grøn) og β-actin (700 nm kanal-rød) fluorescerende signaler. Det andet panel er single-channel fluorescenspåvisning af den samlede BIM på den samme membran, blev separeret ved hjælp af et barberblad baseret på molekylvægtene af disse målproteiner. De nederste tre Western blot-paneler er de sorte og hvide billeder af de separerede enkelt kanal fluorescerende billeder.

Figur 2. Et eksempel på både en høj og dårlig kvalitet Western blot-billede ved hjælp af infrarød fluorescens. WM793 melanomaceller behandlet med enten DMSO (CTL) eller 2 pM af MEK-inhibitor, PD0325 901 (Meki) i 18 timer blev analyseret som beskrevet i figur 1.. Membranen blev probet med kanin-anti-phospho-ERK1 / 2 (Thr202/Tyr204), muse-anti-total ERK1 / 2, og muse-anti-phospho-BIM (Ser69) med antigen-antistof-komplekser detekteres med gede-anti-kanin IRDye 800 (grøn) og gede anti-mus IRDye 680 (rød). Den første Western blot panel er overlejring af den samtidige påvisning af både fosfor ERK1 / 2 (800 nm kanal-grøn) og de samlede ERK1 / 2 (700 nm kanal-rød) fluorescerende signaler. Den anden og tredje paneler er de sorte og hvide billeder af de enkelte kanaler fluorescerende billeder af fosfor og total ERK1 / 2. De nederste to paneler er de fluorescerende og sorte og hvide billeder af fosfor BIM. Disse billeder er et eksempel på et afsnit Western blot, der kan resultere i denne metode på grund af deklasserede af det primære antistof.

p_upload/51149/51149fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51149/51149fig3.jpg "/>
Fig. 3. Eksempler på protein kvantificering af de infrarøde fluorescerende Western blotting. A) Kvantificering af total ERK1 / 2, β-actin, og den samlede BIM proteinniveauer blev bestemt ved at beregne den integrerede intensitet af hvert protein band. Den integrerede intensitet er proportional med mængden af ​​fluorescensmærkede sekundære antistoffer på membranen. R-kvadrerede værdier blev også anvendt til at vurdere den lineære regression for hvert af antistofferne analyseret i fig. 1. B) Kvantificering af phospho-ERK1 / 2 normaliseret til total ERK1 / 2 proteinniveauer fra figur 2 blev beregnet ved hjælp af den integrerede intensitet af fluorescenssignal og data er præsenteret som en procentdel af DMSO-kontrol.

Discussion

De kritiske trin i at skabe høj kvalitet, kvantitative Western blots i henhold til denne protokol, er følgende: 1) måling af protein-koncentrationer, 2) prøveforberedelse, 3) at blokere membranen og 4) kvalitet og kaliber af det primære antistof.

Nøjagtigheden af ​​måling af det samlede protein-koncentrationer kan have en stor indvirkning på kvantificere proteinbåndene da den usædvanlige følsomhed infrarødt fluorescerende afsløring vil forstærke eventuelle små forskelle, der findes i protein koncentrationen af ​​prøverne. For at undgå uoverensstemmelser i bestemmelse af koncentrationen protein, genererer en standard kurve med en lineær regressionslinje eller R-kvadrerede værdi så tæt på 1 som muligt ^(R2 ≥ 0,99 eller bedre) er vigtig i den præcise beregning af proteinet i hver prøve . For eksempel, hvis ^R2 værdien falder til under 0,99, forbereder friske BSA standarder med ultrarent vand og omhyggeligt gentageprotein kvantificering assay kan bidrage til at øge ^R2 værdi. Det er også bedst at undgå at bruge en multikanalspipettor da dette vil generere uoverensstemmelser i pipettering der kan bidrage til reduceret R ^2-værdier og unøjagtigheder i proteinet koncentrationer af prøverne.

Prøveforberedelse spiller en væsentlig rolle i bestemmelsen af ​​kvaliteten af ​​protein bands, som også kan have en direkte indflydelse på kvantificering af disse bands. Ved brug af Bis-Tris-gel-system, er det stærkt anbefales, at prøverne er tilberedt med LDS Sample Buffer, fordi let basisk pH (8,5) i denne buffer giver den optimale forudsætning for reduktion af disulfid obligationer og denaturering ^4.. Denne prøve buffer indeholder også en Coomassie G250 sporing farvestof, der producerer en skarp farvefronten der vandrer med de bevægelige ion front, som hjælper med at sikre, at små peptider ikke løber fra gelen ^4.. Vigtigere, LDS SampleBuffer minimerer spaltning af aspartyl-prolyl peptidbindinger når prøver opvarmes ved 70 ° C på grund af pH-værdien af pufferen ændre 8,5-8,0 ^4. Dette resulterer i et ideelt miljø for reduktion og alkylering af proteiner samtidig bevare integriteten af ​​proteinet. Men hvis en Tris-glycin SDS-prøvebuffer anvendes i stedet for LDS prøvebuffer, vil dette føre til spaltning af aspartyl-prolyl obligationer, et fald i skarpheden af proteinbånd, og en stigning protein fragmentering ^4. Det er også relevant at tilføje Antioxidant til Upper bufferkammeret af Mini-celle elektroforese enhed. Da Antioxidant er i stand til at comigrate med prøverne ved neutral pH i Bis-Tris-gel-system, kan det hjælpe med at opretholde proteiner i en reduceret tilstand og beskytte disulfid obligationer samt følsomme aminosyrer mod oxidation, mens fraværet af Antioxidant kan føre til diffust proteinbånd ^4. Endelig er det yderstanbefales at bruge enten MES eller MOPS Running Buffer med Bis-Tris geler i modsætning til anvendelse af Tris-Glycin SDS Running Buffer med disse typer af geler. Kombinationen af Tris-Glycin SDS Running Buffer og Bis-Tris geler resulterer i den langsomme vandring af glycin ioner forårsager en dramatisk stigning i elektroforese køretid med bands optræder mere komprimeret og skålformet ^4.

Den blokerende trin er også afgørende for at producere høj kvalitet, Western blot billeder med fluorescerende detektion, da mange af de forskellige blokerende midler kan generere høj membran baggrund. For infrarødt fluorescerende detektion, er det bedst at bruge Odyssey Blokeringsbuffer fordi denne særlige standsende middel øger følsomheden af ​​protein opdagelse og samtidig opretholde lav baggrund. Selv fedtfri tørmælk, kasein, eller BSA også kunne bruges som alternative blokeringsmidler, kan disse typer af løsninger medføre højere baggrund membran og i nogle tilfælde et fald i bindienng affinitet for det primære antistof ^10. Desuden kan mælkebaserede blokkere indeholder IgG, der kan krydsreagere med phospho-epitoper og anti-gede-antistoffer, der kan interferere med nøjagtigheden af protein detektion og korrekt antistofbinding ^9,11. Men hvis en Western blot-billede er plaget af høj baggrund, ikke-specifikke bånd eller svage / nej signal, så at udnytte en af ​​disse alternative blokeringsmidler kan bidrage til at forbedre kvaliteten af ​​billedet. Desuden anbefales det også at undgå at tilføje vaskemiddel til det blokerende trin og lange blokerende inkubationer, da dette kan føre til en stigning i baggrunden og / eller tab af target protein fra membranen ^9,12.

Samtidig detektering af to forskellige antigener på samme blot under anvendelse af infrarøde antistoffer mærket med en 700 nm og 800 nm kanal farvestof kræver forsigtig udvalg af både de primære og sekundære antistoffer. De to primære antistoffer skal afledes fra forskellige hot arter. For eksempel, hvis en primær antistof er afledt fra kanin, derefter det andet primære antistof skal være afledt fra en anden art end kanin forskellige arter, såsom mus. Tilsvarende skal også de infrarøde sekundære antistoffer at være afledt fra den samme vært art som hver af de primære antistoffer og mærket med forskellige fluoroforer. For eksempel kan et gede-anti-kanin i 800 nm kanal kombineres med et gede-anti-mus i 700 nm kanal for nøjagtigt at observere protein signal fra to forskellige primære antistoffer, der er afledt fra kanin og mus.

Primære antistoffer varierer betydeligt i deres kvalitet, affinitet og følsomhed for deres antigen. Dette kan resultere i en betydelig reduktion i signal eller en stigning i specifik binding af proteiner til membranen og dermed skabe vanskeligheder nøjagtigt visualisere målproteinet. Således, ved hjælp af en alternativ blokerende opløsning, såsom fedtfri mælk ellerkasein opløst i PBS, kan bidrage til at forbedre protein detektion med dårlig kvalitet primære antistoffer ^10. Desuden kan detergentkoncentrationen også påvirke binding af det primære antistof til målantigenet og forsigtighed skal overvejes ved bestemmelse af koncentrationen af ​​detergent med henblik på at undgå at vaske væk antistoffet. En lav koncentration af SDS (0,01-0,02%) kan reducere baggrund og ikke-specifik binding, når de tilsættes til den fortyndede sekundære antistof, især ved anvendelse af PVDF-membran ^10. Dog kan SDS også forstyrre antigen-antistof-binding fører til en alvorlig reduktion i signalstyrke.

Endvidere er de hidtil ukendte ændringer i denne protokol beskrevne eksempel på en moderne tilgang til traditionelle Western blotting teknik. Disse banebrydende fremskridt drastisk forbedre effektiviteten, konsistens, og følsomheden af ​​vestlige data og giver mulighed for nøjagtig kvantificering af flere target-proteinerpå den samme membran uanset deres signalstyrke. Vigtigere, at disse værdifulde ændringer også reducere den eksperimentelle tid udføre en Western blot samtidig producere høje kvalitative og kvantitative data betydeligt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15-well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue Plus2 Prestained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A