Os microtúbulos são inerentemente instáveis polímeros, e sua alternância entre crescimento e redução é estocástico e difícil de controlar. Aqui nós descrevemos protocolos utilizando microtúbulos segmentados com tampas de estabilização photoablatable. Despolimerização dos microtúbulos segmentados pode ser acionado com alta resolução temporal e espacial, ajudando assim a análise de movimentos com a desmontagem extremidades dos microtúbulos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Preparação de Segmentadas Microtubules para estudar Moções impulsionado pela desmontagem de microtúbulos Termina
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microtubule despolimerização pode fornecer força para o transporte de diferentes complexos de proteínas e pérolas revestidas de proteínas in vitro. Os mecanismos subjacentes são pensados para jogar um papel vital nos movimentos do cromossoma dependente de microtúbulos durante a divisão celular, mas as proteínas relevantes e suas funções exatas são mal definido. Assim, existe uma necessidade crescente de desenvolver ensaios com a qual para estudar tal motilidade in vitro, utilizando os componentes purificados e meio bioquímico definido. Os microtúbulos, no entanto, são intrinsecamente instáveis polímeros, a sua comutação entre crescimento e encurtamento é estocástica e difícil de controlar. Os protocolos que descrevemos aqui aproveitar os microtúbulos segmentados que são feitos com o photoablatable estabilização caps. Despolimerização desses microtúbulos segmentados podem ser acionados com alta resolução temporal e espacial, ajudando assim os estudos de mobilidade nas extremidades desmontagem dos microtúbulos. Esta técnica pode ser usada para carry a uma análise quantitativa do número de moléculas em complexos de proteína fluorescente marcado, que se movem com processively dinâmica dos microtúbulos termina. Para optimizar a relação de sinal-para-ruído neste e em outros ensaios fluorescentes quantitativos, lamelas devem ser tratadas para reduzir a absorção não específica de proteínas marcadas fluorescentemente-solúveis. Protocolos detalhados são fornecidos para ter em conta as irregularidades de iluminação fluorescente, e determinar a intensidade de um único fluoróforo usando ajuste de Gauss equidistante. Finalmente, descreve-se o uso de microtúbulos segmentadas para estudar movimentos das microesferas revestidas com proteínas dependentes de microtúbulos, fornecendo insights sobre a capacidade de diferentes proteínas do motor e não motores a par de microtúbulos despolimerização ao movimento de carga processiva.
Introdução
Os microtúbulos são estruturas altamente conservadas do citoesqueleto, que são importantes para a arquitectura celular, motilidade celular, divisão celular e o transporte intracelular 1. Estes polímeros dinâmicas montar a partir de tubulina na presença de GTP, e que exibir espontaneamente entre crescimento e encurtamento 2. Os microtúbulos são muito finas (apenas 25 nm de diâmetro), portanto, técnicas ópticas especiais para melhorar o contraste deve ser usada para observar microtúbulos com um microscópio de luz. Trabalhos anteriores com esses polímeros examinado seu comportamento dinâmico usando contraste de interferência diferencial (DIC) ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Equipamentos necessários: As experiências descritas abaixo exigem um microscópio de luz equipado para DIC e imagens de fluorescência (Tabela 1). Campo brilhante iluminação LED pode ser utilizado para melhorar significativamente a detecção dos microtúbulos sementes ligado à lamela 37, que são difíceis de observar com uma lâmpada de halogéneo regular. Para controlar o fluxo de líquido em câmaras de microscopia, as soluções devem ser trocados com uma bomba peristáltica capaz de velocidades de fluxo de 10-100 ul / min. Uma bomba de seringa também pode ser usado, mas deve ser tomado cuidado para evitar bolhas de ar que possam f....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Rastreamento com despolimerizando microtúbulos Protein termina. Yeast kinetochore componente Dam1 é de longe o melhor ponta-tracker do microtúbulos despolimerizando termina 14. O complexo de 10-subunidade marcada com GFP podem ser facilmente expressas e purificadas a partir de células bacterianas 18,38, portanto, recomendado usá-lo como um controlo positivo para o ensaio de localização da ponta. Uma proteína fluorescente que controla o fim da despolimerização de microtúbulos é vist.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Muitos ensaios única molécula hoje em dia usam rotineiramente lamelas especialmente tratadas para reduzir drasticamente a aderência proteína inespecífica. O procedimento que descrevemos aqui é uma modificação do protocolo original desenvolvido no laboratório de Howard 32, e nós achamos que silanizar as lamelas vale bem a pena o esforço, mesmo com ensaios de contas baseadas em DIC, que não utilizam a fluorescência. Câmaras montadas com tais lamelas mostram superfícies muito mais limpas, e os resultados obtidos.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a FI Ataullakhanov para ajudar a projetar e fabricar câmaras de fluxo reutilizáveis, N. Dashkevich, N. e A. Gudimchuk Korbalev para fornecer imagens para figuras, N. Gudimchuk e P. Zakharov para o desenvolvimento de um protocolo e fornecendo reagentes para preparar sementes de microtúbulos marcadas com digoxigenina, A. Potapenko ajuda com edição de texto e outros membros da Grishchuk laboratório para dicas e discussões. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH conceder GM R01-098389 e uma concessão piloto da Pensilvânia Muscle Instituto ELG, que é um Kimmel Scholar, por RFBR concede 12-04-00111-a, 13-04-40190-H e 13 -04-40188-H....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tabela 1. Microscopia e outros equipamentos. | |||
| Microscope | Zeiss Nikon | Axio Imager 2 Eclipse Ti | outros modelos de microscópio capazes de DIC e imagens de epifluorescência podem ser usados |
| Objetiva | Zeiss Nikon | 420490-9900-000 CFI Apo 100x Oil 1.49 | 100X, DIC, 1.3-1.49 NA |
| Aquecedor de objetiva | Bioptechs | 150803, 150819-19 | |
| Cubo de filtro fluorescente | Chroma | 49004 ou 49008 41017 ou 49020 | otimizado para fluorescência de rodamina otimizado para software de aquisição de fluorescência GFP |
| freeware MicroManager Molecular Devices | não aplicável MetaMorph 7.5 | http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ outro software pode ser usado para adquirir imagens e para um rastreamento de partículas | |
| Câmera EMCCD | Andor | iXon3, DU-897E-cs0-#BV | Câmera EMCCD altamente sensível |
| Laser de captura | IPG Photonics | YLR-10-1064-LP | Laser de 1.064 nm, lasers |
| de excitação de fluorescência | Coherent, Inc. Coherent, Inc. | Sapphire 488 LP Sapphire 552 LP | excitação de fluoróforos verdes excitação de fluoróforos vermelhos |
| Limpador de plasma | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Câmaras de fluxo comercial | Warner Instruments | RC-20 ou RC-30 | |
| Bomba de perfusão | Cole Palmer Harvard Apparatus | Masterflex 77120-52 Pico Plus | Ambas as bombas fornecem a taxa necessária de fluxo de líquido, mas uma bomba peristáltica pode pulsar em velocidade muito lenta. O fluxo com uma bomba de seringa é mais consistente para uma ampla gama de taxas, mas esta bomba tem inércia. |
| Tabela 2. Preparação da câmara de microscopia. | |||
| Lâminas de microscópio modificadas para câmaras reutilizáveis | Sopro de vidro de precisão do Colorado | Pedido personalizado www.precisionglassblowing.com | Slots sônicos em lâminas usando esquemas em Figura 1 |
| Tubo de polietileno | Intramedic | 427410 | I.D. 0,58 mm, O.D. 0,965 mm; use esses tubos para conectar a câmara montada à bomba e ao recipiente de resíduos |
| Tubo de polietileno | Intramedic | 427400 | I.D. 0,28 mm, O.D. 0,61 mm; use estes tubos para fazer a câmara reutilizável |
| Lâminas de microscópio regulares | VWR | 48312-003 | Outras lâminas semelhantes podem ser usadas |
| Lamínulas | VWR | 48393-150, 48366-067 | Outras lamínulas semelhantes podem ser usadas |
| Selante de silicone | World Precision Instruments | KIT, SELANTE DE SILICONE 5 MIN CURA | |
| Cola epóxi | Loctite | 83082 | |
| Adesivo de cianoacrilato | Scotch 3M | AD114 | Ou adesivo de cianoacrilato de outros fabricantes |
| Tabela 3. Limpeza e revestimento de lamínulas.fortes | |||
| , grau 564 | Macron | 4490-04 | |
| Frasco de coloração de lamínula | Ted Pella, Inc. | 21036 | |
| Suporte de Cerâmica para Lamínula | Thomas Scientific | 8542e40 | |
| PlusOne Repel Silane | GE Healthcare Biosciences | 17-1332-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Anti-digoxigenina AB | Roche Applied Science | 11093274910 | |
| Tabela 4. Preparação de sementes e microtúbulos segmentados. | |||
| Tubulin | purificada de cérebros de vaca Cytoskeleton, Inc | T238P | Para protocolos de purificação, consulte 49– 51 Tubulina suína não marcada |
| Citoesqueleto de tubulina marcada | com citoesqueleto, Inc Invitrogen Invitrogen | TL590M C1171 (rodamina) A-2952 (digoxigenina) | Tubulina suína marcada com rodamina A tubulina pode ser rotulada com qualquer corante reativo à amina como na referência52. |
| GMPCPP | Jena Biosciences | NU-405 | Alíquota e loja em -70 ° C |
| VALAP | Vaselina, lanolina e parafina a 1:1:2 em massa | consulte a referência9 |
Referências
- Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 83-117 (1997).
- Mitchison, T. M., Kirschner, M. W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
- Walker, R. A., Brien, O., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
