Nós descrevemos um protocolo de PCR em tempo real para o perfil de microRNAs no líquido cefalorraquidiano (LCR). Com a excepção dos protocolos de extracção de ARN, o procedimento pode ser estendido para o RNA extraído a partir de outros fluidos do corpo, as células cultivadas, ou amostras de tecido.
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Artigo de método
Líquido cefalorraquidiano MicroRNA perfil usando Quantitative PCR em Tempo Real
Neste artigo
Resumo
Resumo
MicroRNAs (miRNAs) constituem uma camada poderosa de regulação gênica, orientando RISC para atingir sítios localizados em mRNAs e, conseqüentemente, modulando sua repressão translacional. Alterações na expressão de miARN têm mostrado estar envolvidas no desenvolvimento de todas as principais doenças complexas. Além disso, resultados recentes demonstraram que os miRNAs pode ser secretada para o meio extracelular e entram na corrente sanguínea e outros fluidos corporais onde pode circular com elevada estabilidade. A função de tais miRNAs circulantes permanece difícil, mas as abordagens de alto rendimento sistemáticos, tais como matrizes de perfil miRNA, levaram à identificação de assinaturas miRNA em várias condições patológicas, incluindo doenças neurodegenerativas, e vários tipos de cancros. Neste contexto, a identificação do perfil de expressão de miRNA no líquido cefalorraquidiano, como relatado em nosso estudo recente, faz miRNAs candidatos atraentes para análise de biomarcadores. _content "> Existem várias ferramentas disponíveis para perfilar microRNAs, tais como microarrays, quantitativa PCR em tempo real (qPCR) e seqüenciamento de profundidade. Aqui, descrevemos um método sensível para o perfil de microRNAs em fluidos cerebrospinal por quantitativa PCR em tempo real. Nós utilizados os painéis humanos PCR prontos para uso Exiqon microRNA I e II V2.R, que permite a detecção de 742 microRNAs humanos únicos. Realizamos as matrizes em triplicado corridas e nós processados e analisados dados usando o software GenEx Professional 5.
Usando este protocolo, temos perfilado com sucesso microRNAs em vários tipos de linhas celulares e pilhas, CSF, plasma e tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina.
Introdução
MicroRNAs pertencem à família de pequenos (21-23 nt de comprimento) não codificante ARN que regulam a expressão do gene de pós-transcricionalmente. microRNAs pode ser secretada no espaço extracelular, onde eles parecem ser relativamente estável. Ao determinar mudanças na expressão de miRNA pode ser um passo importante para identificação de biomarcadores, realizando perfis de miRNA e lidar com uma grande quantidade de dados pode ser intimidante.
Aqui, nós descrevemos um protocolo para determinar mudanças na expressão de miRNA no líquido cefalorraquidiano (aplicável a outros fluidos corporais) por um tempo real sensível PCR. Nós também desc....
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Protocolo
O protocolo a seguir descreve o procedimento padrão para isolar RNA de LCR e de perfil microRNAs usando placas de PCR prontos. Note-se que a extracção de fase orgânica é opcional, e que um ARN transportador é adicionado à amostra durante a extracção para assegurar a recuperação máxima de ARN. Consequentemente, não há necessidade de quantificar o ARN.
Em geral, a média de 6-8 placas pode ser executado no mesmo dia que o cDNA é sintetizado no dia anterior (cerca de 2 horas). A análise dos dados é executada quando todas as amostras tiverem sido perfilado e carregada no software. Dependendo do número de amostras / grupos ou a sua combinação p....
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Resultados
Os resultados deste estudo foram publicados anteriormente 1. Figura 1 mostra os resultados da análise de microRNAs de referência candidatos usando o aplicativo geNorm. Por conseguinte, dois microRNAs, miR-622 e miR-1266, foram identificados como genes de referência e foram usadas para normalizar os valores de miRNA.
Para o estudo CSF que tinha três grupos de amostras: VIH-(n = 10), COLMEIA (n = 4), e HIV + sem Encefalite (VIH +, n = 5). .......
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Discussão
MicroRNAs são pequenos RNAs não codificadores que regulam a expressão de genes, inibindo a tradução e / ou a promoção da degradação do mRNA 2. Devido à sua elevada estabilidade em condições livres de células, microRNAs foram detectados em muitos fluidos corporais. Além disso, o perfil de expressão de microRNAs distinta tem sido correlacionada com o estágio e / ou progressão em uma variedade de cânceres humanos 3-9.
Existem várias ferramentas disponíveis para o perfil de.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O projeto descrito foi apoiada pelo Prêmio Número R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) do Instituto Nacional de Saúde Mental. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional de Saúde Mental ou o National Institute of Health.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
Tabela 3. Lista de equipamentos. | |||
| Finnpipette Novus Multichannel Pipetter | Thermo Scientific | HH05279 | |
| Finntip Pipetas Tips | Thermo Scientific | 9400613 | |
| Termociclador C1000 | Biorad | ||
| 0,2 ml Low Profile, Tubos de PCR transparentes | Biorad | TLS0801 | |
| Flat Cap Strips | Biorad | TLS0803 | |
LightCycler 480 Sistema de PCR em Tempo Real | Roche | ||
LightCycler 480 Folha de Vedação | Roche | 04 729 757 001 | |
| Centrífuga Refrigerada 5804R | Eppendorf | ||
| Rotor de caçamba oscilante, 4 lugares | Eppendorf | A-4-44 | |
| Mini Centrífuga de Bancada | Fisher | 05-090-100 | |
| Vórtice de Bancada | Fisher | ||
| Tubos de Microcentrífuga de 1,5 ml, Esterilizados | Fisher | 02-681-5 | |
| Reservatório de Reagente Matrix, 25 ml | Thermo Scientific | 8093 | |
| Thermomixer Confort | Eppendorf | ||
Centrífuga de Bancada Sigma 1-15 | Sigma | ||
| Vórtice de bancada | Velp Scientifica | F202A0173 | |
Tabela 4. Lista de reagentes. | |||
| Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns | Exiqon | 203300 | |
| SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml | Exiqon | 203400 | |
| Ultrapure Dnase de Água Destilada, Rnase free | Invitrogen | 10977-015 | |
| MicroRNA Pronto para usar PCR Painéis Humanos (I+II) V2.R | Exiqon | 203608 | |
mirKit de isolamento de miRNA Vana, 40 isolamentos | Ambion | AM1556 | |
| MS2 transportador de RNA | Roche Applied Science | 10165948001 | |
2-mercaptoetanol 98% | Sigma Aldrich | M3148-25ml | |
| Etanol 100% | Carlo Erba | 64-17-5 | |
| Água livre de nuclease | Qiagen | 1039480 | |
RNAse Zap | Ambion | AM9780 |
Referências
- Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (20....
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Reimpressões e permissões
