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Artigo de método

A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

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DOI:

10.3791/51174

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23 de fevereiro de 2014

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1Department Genetics of Microorganisms, Interfaculty Institute for Genetics and Functional Genomics, University of Greifswald

Neste artigo

Resumo

Streptococcus pneumoniae é o patógeno principal causador da pneumonia adquirida na comunidade grave e responsável por mais de 2 milhões de mortes em todo o mundo. O impacto dos fatores bacterianos implicados em fitness ou virulência pode ser monitorado em tempo real em uma pneumonia ou bacteremia modelo aguda mouse usando bactérias bioluminescentes.

Resumo

A pneumonia é um dos principais problemas de saúde nos países em desenvolvimento e países industrializados e está associada com morbidade e mortalidade considerável. Apesar dos avanços no conhecimento desta doença, a disponibilidade de unidades de terapia intensiva (UTI), eo uso de antimicrobianos potentes e vacinas efetivas, as taxas de mortalidade continuam altas 1. Streptococcus pneumoniae é o principal patógeno da pneumonia adquirida na comunidade (PAC) e uma das causas mais comuns de bacteremia em humanos. Este patógeno é equipado com um arsenal de adesinas de superfície exposta e fatores de virulência que contribuem para pneumonia e doença pneumocócica invasiva (DPI). A avaliação do papel in vivo de aptidão ou de virulência fatores bacterianos é de extrema importância para desvendar S. mecanismos de patogenicidade pneumoniae. Modelos murinos de pneumonia, bacteremia e meningite estão sendo usados ​​para determinar o impacto de fatores pneumocócicas em difrente fases da infecção. Aqui nós descrevemos um protocolo para monitorar em tempo real a divulgação pneumocócica em ratos após intranasal ou infecções intraperitoneais com bactérias bioluminescentes. Os resultados mostram a multiplicação e difusão de pneumococos no tracto respiratório inferior e do sangue, que pode ser visualizado e avaliada utilizando um sistema de imagem e o software de análise que a acompanha.

Introdução

Infecções respiratórias causadas por vírus ou bactérias continuam a ser um dos problemas adquiridas na comunidade ou clínicas mais comuns em todo o mundo, causando cerca de um terço de todas as mortes no mundo inteiro. As espécies de bactérias principais são o Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae 2. No entanto, estas espécies de bactérias são normalmente constituintes comuns da flora natural do tracto respiratório. Assim, a carga bacteriana também é de certo risco para doença invasiva e, dependendo do estado imunitário ou predisposições dos indivíduos. A colonização assintomática é acionado para infecções invasivas. Streptococcus pneumoniae é o principal patógeno da pneumonia adquirida na comunidade (PAC) e uma das causas mais comuns de bacteremia em humanos. Em indivíduos saudáveis ​​S. pneumoniae (pneumococo) são muitas vezes assintomáticas colonizadores e inofensivos do trato respiratório superior, onde são confrontados com bactérias não patogênicasda flora residente, mas também com agentes patogênicos, como Haemophilus spp. ou de Staphylococcus aureus e a primeira linha de defesa do sistema imunitário humano. A freqüência de colonização são os mais altos em crianças pequenas (37%) e ainda mais dentro de creches lotadas (58%) 3-5. A população mais jovem e os idosos, que recebe o pneumococo através da transmissão aerossol de operadoras e secreções nasofaríngeas 6, pertencem aos grupos de alto risco e vacinação utilizando uma das vacinas conjugadas pneumocócicas (PCV10 ou PCV13 em crianças e polissacarídica 23-valente PPSV23 em adultos) É recomendado nos Estados Unidos (EUA) e muitos países europeus 4. O PPSV23 cobre sorotipos responsáveis ​​por ~ 90% das doenças pneumocócicas bacteremia em os EUA e na Europa, evitando, assim, doenças pneumocócicas invasivas de forma eficiente (IPD) em adultos, enquanto as PCVs cobrir os sorotipos mais prevalentes em crianças. Consequentemente, IPD devido a tipos de vacinas (VT) são redusorotipos não incluídos na vacina ced mas exibindo um elevado potencial de virulência e resistência a antibióticos surgiram 4,7-12. A nasofaringe como o reservatório é o ponto de partida para pneumococos a se espalhar para os seios ou orelhas médias iniciando infecções locais prejudiciais. Mais importante ainda, pneumococos espalhar diretamente através das vias aéreas ao brônquios e pulmão, resultando em CAP risco de vida 4,13. Infecções pulmonares são frequentemente acompanhadas com e destruição do tecido de barreira, permitindo que o agente patogénico a propagar-se no sangue e causar IPD. As incidências de PAC e IPD são mais elevados em pessoas imunocomprometidas ou nos extremos da idade 4,13. As circunstâncias responsáveis ​​pela conversão de um comensal a um patógeno com alta virulência ainda estão em debate. No entanto, têm sido sugeridas, além mudanças na suscetibilidade do hospedeiro e adaptação evolutiva acompanhado com maior virulência eo aumento da resistência a antibióticos para ter um impacto crucial sobre PNEinfecções umococcal 14-16.

O patógeno é dotado de uma multiplicidade de adesinas mediando o contato íntimo com as células epiteliais da mucosa. Depois de superar o muco das vias aéreas, a adesão às células hospedeiras pneumocócica é facilitada através de interações diretas de adesinas de superfície exposta com receptores celulares e através da exploração de componentes da matriz extracelular ou proteínas séricas como ponte moléculas 4,17,18. Patógenos tão versátil pneumococos também estão equipados com fatores envolvidos na evasão dos mecanismos de defesa do hospedeiro imune. Além disso, eles têm a capacidade de se adaptar a ambientes diversos hospedeiros, tais como o pulmão, sangue e fluido cerebrospinal (CSF), respectivamente 5,17,19,20.

O impacto dos fatores bacterianos sobre patogênese e inflamatória do hospedeiro respostas é investigada em modelos animais experimentais de pneumonia, bacteremia ou meningite 21-25. Apesar de ser um patógeno humano, estes modelos são nósll-estabelecidos para decifrar tropismo pneumocócica tecidos, mecanismos de virulência, ou protectivity de vacinas pneumocócicas. O fundo genético de linhagens puras determina a susceptibilidade a pneumococos. Ratinhos BALB / c por via intranasal infectados com pneumococos foram consideradas resistentes, enquanto que a CBA / Ca e SJL ratinhos eram mais susceptíveis às infecções pneumocócicas 22. Isto implica que, semelhante aos seres humanos, o fundo genético e os mecanismos de defesa do hospedeiro determinar o resultado da infecção. Por isso, são necessárias para desvendar locos de resistência no genoma de ratinhos menos susceptíveis a infecções por pneumococos esforços suplementares. Os resultados levaram a mudanças na in vivo protocolos de virulência. Em vez dos ratinhos BALB / c consanguíneos muitas vezes utilizados no passado, as estirpes de ratinho outbred CD-1/MF1 altamente sensíveis são hoje em dia, muitas vezes utilizado para estudar o efeito de virulência ou aptidão pneumocócica perda de função factores 26-28. Além disso, a disponibilidadede pneumococos bioluminescente e técnicas de imagem óptica permite que o tempo real de bioluminescência bioimaging de infecções. Em pneumococos a cassete do gene luxABCDE optimizado (plasmídeo Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) foi inserido num local de integração único de cromossoma por mutagénese por transposões. Pneumococos bioluminescente têm sido empregados para avaliar a atenuação de mutantes pneumocócicas deficientes em virulência ou aptidão fatores e sua translocação de um sítio anatômico para outro 26,28-31.

Aqui nós fornecemos um protocolo para a bioimaging das infecções pneumocócicas em uma pneumonia ou modelo murino sepse. A amplificação e disseminação de pneumococos bioluminescente em ratinhos por via intranasal ou por via intraperitoneal infectadas podem ser facilmente monitorizados ao longo do tempo utilizando um sistema de imagiologia óptica e do mesmo animal em diferentes pontos de tempo.

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Protocolo

Os experimentos de infecção de animais aqui descritos devem ser executados em estrita conformidade com o (por exemplo, o direito europeu de Saúde da Federação das Associações de Laboratório Ciência Animal (FELASA)) local e internacional diretrizes e normas para o uso de animais vertebrados. Os experimentos têm de ser aprovados pelo conselho de ética local e do Comitê Animal Care Institucional. Todas as experiências com S. pneumoniae no laboratório ou as infecções animais são conduzidos em uma Classe II Biossegurança Gabinete.

1. Preparação de Doenças Infecciosas da Bolsa de Bioluminescent Pneumocococi

  1. Prepare culturas estoque de pneumococos em caldo de Todd-Hewitt suplementado com 1% (w / v) de extracto de levedura e uma concentração final de 20% de glicerol para a manutenção a 80 ° C.
  2. Placa de uma pequena quantidade de cultura de pneumococos ultracongelado sobre uma placa de agar de sangue e incubar as bactérias durante 10 horas a 37 ° C em 5% de CO 2. Tele placa de ágar de sangue contém os antibióticos adequados, tais como canamicina (150 ng / ml) para a inserção de transposões da cassete do gene luxABCDE no genoma.
  3. Sub-cultivar uma nova colônia para uma nova placa de ágar sangue para um máximo de 10 horas.
  4. THY inocular meio suplementado com 10% (v / v) inactivado pelo calor (30 min a 56 ° C) de soro fetal bovino (FBS) com pneumococos e iniciar a cultura a uma DO 600 de 0,05-0,07.
  5. Incubar pneumococos, sem agitação, a 37 ° C e 5% de CO 2 até a cultura atingir uma OD 600 de 0,35-0,40. Crescimento levará entre 3-4 horas.
  6. Colheita pneumococos por centrifugação a 3750 xg durante 10 min e ressuspender pneumococos bioluminescente em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 (PBS) suplementada com 0,5% de FBS.
  7. Ajustar o inoculo para a concentração desejada em PBS/10% de FBS. A dose infecção depende da cepa de pneumococo utilizado eo fundo genético do microfonee. Para infectar outbred ratinhos CD-1 por via intranasal com S. pneumoniae D39 lux a dose de infecção deve ser ajustada a 1 x 10 7 UFC de uma suspensão de 20 ul suplementados com 90 unidades de hialuronidase. Não agite ou vórtice pneumococo, uma vez que este irá desencadear autólise.
  8. Verificar a concentração de inoculo por plaqueamento de 10 diluições em série de dobragem em agar de sangue e contagem das colónias após crescimento durante a noite a 37 ° C em 5% de CO 2.
  9. Verifique a bioluminescência do inoculo pneumocócica medindo a bioluminescência utilizando um sistema de imagem óptica.

2. Intranasal e Infecção intraperitoneal de camundongos com Bioluminescent pneumococos

  1. Utilizar ratos fêmea consanguíneos na idade de 7-10 semanas para o modelo de pneumonia aguda e sépsis. O peso destes ratinhos deve estar entre 20-30 g.
  2. Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de ketamina e xilazina. Prepara-se uma mistura de 1,0 mgde cetamina e xilazina 0,1 mg em 100 ul estéril a 0,9% (w / v) de cloreto de sódio para os ratinhos com um peso corporal de 20 g. Isto é consistente com uma dose de 50 mg / kg de peso corporal para a cetamina e 5 mg / kg de peso corporal para a xilazina. Para ser exato, pesar camundongos antes da injeção do anestésico.
  3. Injectar a mistura na cavidade intraperitoneal e colocar os animais de volta para dentro da gaiola, até os anestésicos agem e os animais são narcotizada. A respiração dos ratos se tornará muito lento e regular. Os ratos têm de ser totalmente narcotizado, de modo que a inoculação intranasal e inalação da suspensão bacteriana não vai resultar em espirros e, portanto, a perda de inoculo. Isso pode ser avaliado por beliscar o mouse no final de sua cauda; um mouse totalmente narcotizada faltará capacidade de resposta.
  4. Gentilmente pegar um rato narcotizada e segure o mouse entre os dedos eo polegar, com o nariz em pé (Figura 1).
  5. Use uma pipeta com longas pontas estreitas (Gel CarregadorDicas) e soltar pneumococos bioluminescente em várias gotas pequenas para as narinas (10 mL / narina) do mouse 26-29. O rato vai involuntariamente inalar as bactérias. Segure o mouse 1-2 min na posição vertical e observar se o mouse espirra ou mantém o inóculo.
  6. Infect 7-10 semanas de idade ratinhos CD-1 por via intranasal com uma dose de infecção de 1 x 10 7 ou 7,5 x 10 7 pneumococos da estirpe D39 e TIGR4, respectivamente, para monitorar a infecção em tempo real. O limite de detecção para o sistema sem qualquer absorção pelo tecido do hospedeiro é de cerca de 1 x 10 6 bactérias bioluminescentes.
  7. Infectar camundongos por via intraperitoneal (IP) para avaliar e BioImage virulência do pneumococo em um modelo de infecção sepsis mouse. Use 5 x 10 3 UFC em 100 ul de D39 tensão e 1 x 10 4 de tensão TIGR4. Ratos não são anestesiados quando se utiliza a via IP.
  8. Inocular camundongos controle com PBS.
    figure-protocol-1
    Figura 1. Infecção intranasal de murganhos CD-1 com S. pneumoniae. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

3. Visualizando pneumocócica Divulgação no Pulmão e Sangue Utilizando o Sistema de Imagem

Imagem de divulgação de pneumococos após a infecção intranasal de camundongos fêmeas outbred CD1 em tempo real usando um sistema de imagem in vivo.

  1. Ligue o sistema de imagem e iniciar o software de análise de imagem localizado no computador pré-configuração.
  2. O sistema de imagem inicia automaticamente e a câmara CCD é termoelectricamente arrefecido a 90 ° C antes de ser activo.
  3. As configurações e binning depender do número de ratinhos medidoe, simultaneamente, com a força do sinal bioluminescente. O campo de visão (FOV) para monitorar a bioluminescência dos animais é variável ea ampliação varia entre um FOV de 22,5 cm a medir cinco ratos, e um FOV de 3,9 cm para medir um único rato ou partes do animal como o peito ou na cabeça.
  4. Use rotineiramente um tempo de exposição de 1 min, um grau médio de binning, e um FOV de 22,5 cm (conjunto D). Em primeiro lugar, selecione o modo de imagem luminescente e, em seguida, definir os parâmetros de imagem.
  5. A emissão do sinal pode depender da estirpe bacteriana e estirpe de ratinhos utilizada, e o pigmento do rato. Raspar o peito dos ratos quando se utiliza por exemplo, ratinhos C57BL / 6, o que pode ser vantajoso na obtenção de imagens do desenvolvimento da pneumonia nestes ratinhos.
  6. Imagem ratinhos infectados, a intervalos de tempo previamente escolhida. Medir a bioluminescência de ratos no modelo de pneumonia aguda em intervalos de tempo de 8-12 horas no máximo. Monitorar também o bem-estar de camundongos infectados por observing sua aparência, comportamento e determinação da perda de peso.
  7. Anestesiar os ratos na câmara narcótico do sistema de anestesia do equipamento de imagem antes das medições na câmara. Comece a inalação de uma mistura de isoflurano e oxigênio e esperar até que os camundongos respirar lenta e regularmente.
  8. Coloque animais anestesiados para a câmara de formação de imagens do sistema e manter os ratos na posição supina. A câmara CCD sobre a parte superior da câmara será então a imagem do tracto respiratório murino.
  9. Colocar os animais com o seu nariz em tubos para permitir a inalação do anestésico.
  10. Isoflurano entrada para a câmara de imagiologia por meio de uma tubagem de gás é permitido para manter a anestesia.
  11. Para ativar a câmera CCD no topo da câmara e começar a imagem óptica bioluminescente, pressione "Acquire" no software de imagem. Imediatamente uma fotografia dos ratinhos na câmara fechada, aparece no ecrã. Após um minuto de medição uma sobreposição dos dados bioluminescência ea foto é mostrada.
  12. Pare de anestesia após a sobreposição de imagem aparece na janela do software e colocar os ratos de volta em suas gaiolas.
  13. Ratos são monitorados para a recuperação.
    figure-protocol-2
    Figura 2. Anestesia e monitoramento de camundongos infectados com pneumococos bioluminescente utilizando a anestesia eo sistema IVIS IVIS Spectrum, respectivamente. A) O sistema IVIS Spectrum imagem. B) O sistema de anestesia IVIS com a câmara de incubação. C) Ratos anestesiados na câmara de incubação . D) Ratos localizado no interior da câmara IVIS Espectro de imagem com o nariz a inalação do anestésico._blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.

4. Quantificação e Avaliação da bioluminescência de camundongos infectados com S. Bioluminescent pneumoniae

  1. Determinar as intensidades de bioluminescência dos ratos ou de uma região seleccionada dos ratinhos por quantificar a emissão de fotões totais (fotões / sec) usando o software de análise de imagem.
  2. Use os valores da emissão de fótons que são fornecidos em uma folha de dados do Excel para preparar um gráfico. Uma vez que a variação de dados é frequentemente elevado nos ratinhos agrupados, gerar um gráfico de caixa suiça para mostrar as diferenças de ratinhos infectados com diferentes estirpes de pneumococos.
  3. Proporcionar os fotões por ratinhos ou alternativamente os resultados como a média de brilho (fotões / sec / cm 2 / SR) de uma área seleccionada.
  4. Os dados de medição de ROI (região de interesse) no modo de fóton pode ser quantitativamente comparados entre diferentes em sistemas de imagem in vivo com diferente veioconfigurações ra, uma vez que as medidas em unidades de irradiação têm automaticamente em conta as definições da câmara (por exemplo, o tempo de integração, binning, f / stop, e campo de visão).

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Resultados

A aquisição e absorção de metionina é de importância central para pneumococos para manter a forma em seu nicho de acolhimento 32,33. A metionina ABC transportador lipoproteína é codificado em D39 pelo SPD _ 0151 gene (TIGR4: sp_0149) e nomeado METQ 32. Os pneumococos produzir mais enzimas de biossíntese de metionina (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, mete e MetF). A falta de metionina num meio quimicamente definido afecta o crescimento de pneumococos e se...

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Discussão

Todos os experimentos realizados em animais têm de ser aprovados pelas autoridades locais e comissões de ética. Em experiências in vivo de infecção a carga bacteriana nos vários nichos hospedeiras de animais infectados tem de ser determinada a diferentes pontos de tempo após a infecção. Sob estas condições experimentais, os animais têm de ser sacrificados antes do isolamento de bactérias a partir do sangue, a nasofaringe, lavado bronchoalvelar, ou órgãos tais como os pulmões, baço e cérebro. Para calcular...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Pesquisas em laboratório foi apoiado por subsídios da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, 3125/4-2 DFG HA) e do Ministério Federal de Educação e Pesquisa (BMBF) Genomics Infecção Médico (FKZ 0315828A) para SH.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Caldo Todd HewittCarl Roth, Karlsruhe, AlemanhaX936.1 
Extrato de leveduraCarl Roth, Karlsruhe, Alemanha2363.2 
Placas de ágar sangueOxoid, Wesel, AlemanhaPB5039A 
KanamicinaCarl Roth, Karlsruhe, AlemanhaT832.2 
EritromicinaSigma-Aldrich, Taufkirchen, AlemanhaE6376 
Soro fetal bovino (FBS)PAA Laboratories, Coelbe, AlemanhaA11-151 
Camundongos CD-1, fêmeasCharles River, Sulzfeld, AlemanhaCD1SIFE06W08Wcamundongos fêmeas CD-1, seis a oito semanas de idade
Ketamin 500 mg, solução injetável CuramedSchwabe-Curamed, Karlsruhe, Alemanha 
Rompun 2%, solução injetávelBayer Animal Health, Monheim, Alemanha 
Seringas BD Plastipak de 1 mlBecton Dickinson, Heidelberg, Alemanha300015seringas estéreis Luer-Lok com agulha
Pontas de Carregador de GelPeqLab81-13790Mµ Pontas ltiFlex
HyaluronidaseSigma-AldrichH3884-100mgHyaluronidase Tipo IV-S de teste bovino
OxygenAir Liquide, Dü sseldorf, AlemanhaM1001L50R2A001 
IsofluranoBaxter, Unterschleiß heim, Alemanha 
pGEM-T EasyPromega, Mannheim, Alemanha 
Oligonucleotídeos Eurofins MWG, Ebersberg, Alemanha 
Kit Midiprep Spin Qiaprep Qiagen, Hilden, Alemanha27104 
Kit de purificação PCR DNAQiagen, Hilden, Alemanha28106 
Software Living Image 4.1Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Alemanha 
Paquímetro de Sistema de Anestesia a Gás XGI-8Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Alemanha 
Sistema de imagem de espectro IVIS Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Alemanha 
BiofotômetroEppendorf AG, Hamburgo, Alemanha 

Referências

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