Artigo de método

Determinando os planos de ligação de gelo de proteínas anticongelantes pela afinidade do plano de gelo baseado em fluorescência

DOI:

10.3791/51185

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15 de janeiro de 2014

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1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Neste artigo

Resumo

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Proteínas anticongelantes (AFPs) se ligam a planos específicos de gelo para prevenir ou retardar o crescimento do gelo. A análise de afinidade de aviões de gelo baseada em fluorescência (FIPA) é uma modificação do método original de gravação de gelo para determinação de aviões de gelo ligados à AFP. Os AFPs são rotulados fluorescentemente, incorporados em cristais de gelo simples macroscópicos, e visualizados sob luz UV.

Resumo

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As proteínas anticongelante (AFPs) são expressas em uma variedade de organismos resistentes a frio para prevenir ou retardar o crescimento interno do gelo. Os AFPs se ligam a planos específicos de gelo através de suas superfícies de ligação de gelo. A análise de afinidade de plano de gelo baseada em fluorescência (FIPA) é uma técnica modificada usada para determinar os planos de gelo aos quais os AFPs se ligam. A FIPA baseia-se no método original de gravação de gelo para determinar aviões de gelo com destino à AFP. Produz imagens mais claras em um tempo experimental encurtado. Na análise fipa, os AFPs são fluorescentemente rotulados com uma etiqueta quimrica ou um corante covalente e, em seguida, lentamente incorporado em um cristal de gelo único macroscópico, que foi pré-formado em um hemisfério e orientado para determinar os eixos a e c. O hemisfério de gelo ligado à AFP é retratado sob luz UV para visualizar aviões ligados à AFP usando filtros para bloquear a luz inespecífica. A rotulagem fluorescente dos AFPs permite o monitoramento em tempo real da adsorção da AFP no gelo. Os rótulos foram encontrados para não influenciar os planos aos quais os AFPs se ligam. A análise fipa também introduz a opção de vincular mais de um AFP marcado de forma diferente no mesmo cristal de gelo único para ajudar a diferenciar seus planos de ligação. Essas aplicações da FIPA estão ajudando a avançar nosso entendimento de como as AFPs se ligam ao gelo para deter seu crescimento e por que muitos organismos produtores da AFP expressam múltiplas isoformas da AFP.

Introdução

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A produção de proteínas anticongelantes (AFPs) é um importante mecanismo de sobrevivência de alguns organismos que vivem em ambientes carregados de gelo. Até recentemente, pensava-se que a única função das AFPs era prevenir ou retardar o crescimento de cristais de gelo internos que bloqueassem a circulação, causassem danos teciduais e estresse osmótico. Organismos que não toleram qualquer grau de congelamento, como peixes, expressam AFPs para inibir completamente o crescimento de cristais de gelo1. Outros, como a grama, são tolerantes ao congelamento e expressam AFPs para inibir a recristalização do gelo que reduz a formação de grandes cristais de gelo em seus tecidos2. A estabilização das membranas em baixa temperatura é mais uma função sugerida para as AFPs3. Recentemente, um novo papel foi sugerido para a AFP de uma bactéria antártica, Marinomonas primoryensis, dos lagos salgados cobertos de gelo4. Esta AFP faz parte de uma proteína de adesivo5 muito maior que se pensa em anexar a bactéria ao gelo para melhor acesso ao oxigênio e nutrientes6. Outros micróbios são conhecidos por segregar AFPs, o que pode alterar a estrutura do gelo em que vivem7.

AfPs foram encontrados em alguns peixes, insetos, plantas, algas, bactérias, diatomas e fungos. Eles têm sequências e estruturas notavelmente divergentes consistentes com sua evolução de diferentes progenitores em várias ocasiões; e ainda assim todos se ligam ao gelo e inibem seu crescimento pelo mecanismo de inibição de adsorção8. Cada um dos AFPs tem uma superfície específica que atua como seu local de ligação de gelo (IBS). Estes têm sido tipicamente identificados por mutagênese direcionada ao local de resíduos superficiais9-11. O IBS é hipótese para organizar moléculas de água em um padrão semelhante ao gelo que corresponde a planos específicos de gelo. Assim, a AFP forma seu ligante antes de vinculá-lo a ele5, 12. Aviões de gelo podem ser definidos por seus índices Miller, e diferentes AFPs podem se ligar a diferentes planos. Assim, o tipo I AFP do flounder de inverno liga-se aos 20-21 planos piramidários13, tipo III AFP liga tanto os planos prisma primário quanto o piramidal usando uma superfície composta de ligação de gelo11,14, enquanto o budworm de abeto AFP, um AFP hiperativo, liga-se simultaneamente aos planos primários e basais15,16. Outros AFPs hiperativos, como o MPAFP, ligam-se a múltiplos planos de gelo, como mostra a cobertura completa dos hemisférios de cristal de geloúnico 5,17. É hipótese, que a capacidade dos AFPs hiperativos de ligar o plano basal, bem como outros planos, pode explicar sua atividade 10 vezes maior sobre AFPs moderadamente ativa18. Embora a eficiência dos AFPs hiperativos esteja bem documentada, sua capacidade de se ligar a múltiplos planos de gelo ainda não é compreendida.

O método original para determinar os aviões de gelo com destino à AFP foi desenvolvido por Charles Knight13,19. Neste método, um cristal de gelo único macroscópico é montado em uma haste de metal oca (dedo frio) e formado em um hemisfério submergindo-o em um copo hemisférico cheio de água desgassada. Em seguida, o hemisfério é submerso em uma solução diluída de AFPs e uma camada de gelo é cultivada a partir da solução AFP para o hemisfério cristal de gelo ao longo de várias horas controlada pela temperatura do glicol de etileno circulando através do dedo frio. O cristal de gelo é removido da solução, retirado do dedo frio, e colocado em uma sala de congelador de -10 a -15 °C. A superfície é raspada com uma lâmina afiada para remover o filme de superfície congelada da solução de proteína anticongelante e o cristal de gelo é permitido sublimar por pelo menos 3 horas. Após a sublimação, os planos de gelo ligados por AFPs podem ser vistos como padrões brancos gravados derivados de proteína residual. O hemisfério de gelo pode ser orientado para seu eixo ce eixos,para localizar os planos basais e prisma de gelo, e determinar os índices Miller das manchas gravadas.

Aqui descrevemos uma modificação do método original para determinar aviões de gelo vinculados à AFP, um método a que chamamos de afinidade de avião de gelo baseado em fluorescência (FIPA)11. Os AFPs são fluorescentes rotulados com uma etiqueta quimrica, como proteína fluorescente verde (GFP)11,16,17,20, ou com um corante fluorescente covalentemente ligado à AFP5,21. Os AFPs fluorescentes são adsorvidos a um único cristal de gelo e crescidos usando o mesmo procedimento experimental que os experimentos originais de gravação de gelo. A extensão da ligação da AFP ao crescente hemisfério de gelo pode ser monitorada durante todo o experimento usando uma lâmpada ultravioleta (UV). Depois que o experimento estiver completo, o hemisfério pode ser diretamente retirado do dedo frio e imageado, sem sublimação. No entanto, se desejar, o hemisfério pode ser deixado para sublimar para visualizar uma etch de gelo tradicional. Modificações introduzidas na metodologia FIPA encurtam o protocolo tradicional de gravura de gelo em várias horas. Além disso, há o potencial de imagens simultâneas de vários AFPs, cada um com um rótulo fluorescente diferente, para visualizar os padrões sobrepostos de planos de gelo ligados à AFP.

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Protocolo

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1. Crescendo cristais de gelo únicos

  1. Pegue uma panela de metal limpa (15 cm de diâmetro, 4,5 cm de altura) que se encaixe e possa flutuar sobre, um banho de resfriamento etileno glicol.
  2. Preparem os moldes cilíndricos de cloreto de polivinil (PVC), (4,5 cm de diâmetro, 3-4 cm de altura, 4 mm de espessura), serrando seções de um tubo.
    1. Corte um entalhe, (1 mm de largura, 2 mm de altura) em um lado (Figura 1A).
    2. Prepare quantos moldes possam caber confortavelmente na panela (Figura 1B).
      Nota: Estudo mostrou que o álcool polivinyl (PVA) pode afetar a nucleação do gelo22. No entanto, em nosso sistema de PVC de molde aberto não encontramos problemas de formação atípica de gelo.
  3. Aplique uma película leve de graxa de vácuo no anel de superfície inferior de cada molde, que é a superfície com o entalhe cortado. Sele esta superfície untada e entalhada em uma panela de metal com os entalhes orientados para longe do centro da panela. Tenha cuidado para não encher ou obstruir os entalhes com graxa.
  4. Adicione 0,22 μm de água filtrada e desgaseada/desomuionizada ao centro da panela, mas fora dos moldes, e deixe a água entrar lentamente nos moldes através dos entalhes. Tenha cuidado para não introduzir bolhas. A camada de água deve ter aproximadamente 5 mm de profundidade.
  5. Coloque a panela em um banho de etileno glicol controlado pela temperatura resfriado a -0,5 °C. A panela deve estar perfeitamente nivelada. Adicione pesos de lastro nas laterais da panela, se necessário.
  6. Depois que a panela e a água atingirem -0,5 °C, adicione um pequeno pedaço de gelo no meio da panela, fora dos moldes.
    1. Isso nucleará o crescimento do gelo na água superfriada através da panela e nos moldes. O pequeno entalhe na parte inferior de cada molde permite que apenas um cristal de gelo se propague, resultando em um único cristal de gelo em cada molde.
    2. Incubar durante a noite para formar uma camada de gelo.
  7. Ao longo dos próximos três dias adicione 13 ml de água desgassada/desionizada a cada molde uma vez por dia e deixe cair a temperatura do banho de etileno glicol após cada adição a -0,8 °C no primeiro dia, para -1,1 °C no segundo dia, e para -1,5 °C no terceiro dia.
    1. Incubar a essas temperaturas durante a noite.
    2. No quarto dia, os moldes devem estar completamente cheios de gelo.
  8. Retire os moldes da panela, empurre os cristais de gelo para fora dos moldes e armazene em uma superfície limpa, como um barco de pesagem, em um congelador de -20 °C por aproximadamente 1 hora antes de manusear.
  9. Em vez de preparar muitos pequenos cristais de gelo, um grande cristal de gelo de vários litros em volume pode ser preparado em uma incubadora de temperatura constante, como descrito pelo Knight23. O grande cristal de gelo pode ser armazenado por um ano ou mais se mantido coberto em um congelador de -15 a -20 °C. Porções de cristal único podem ser cortadas do bloco de gelo com uma serra conforme necessário.

2. Determinando singularidade e orientação do cristal de gelo

  1. Determine se o gelo expelido do molde é um único cristal observando em uma sala de congelador, entre duas polaroides cruzadas (Figura 1D).
    1. Se o cristal de gelo é único, então não devem ser vistas rachaduras ou descontinuidades, e a direção da luz não deve mudar dentro do cristal de gelo.
      Nota: Se uma sala de freezer não estiver disponível, uma sala fria pode ser usada em todas as etapas necessárias, sendo cautelosa para trabalhar rapidamente e manusear o gelo com moderação.
  2. Devido à birefringência de gelo, pode-se determinar a orientação do eixo cao mesmo tempo. Use as seguintes informações para determinar a orientação:
    1. Quando o eixo cé exatamente paralelo à luz do incidente, em teoria, nenhuma luz passará pelas polaroides cruzadas. Se a luz incidente é intitulada ligeiramente de paralelo com o eixo c,um espectro multicolorido uniforme de luz é transmitido através do cristal quando é girado entre as polaroides cruzadas. Esta transmissão uniforme surge da inatividade óptica do gelo Ih ao longo de seu eixo c24. O plano basal do cristal de gelo é normal para o eixo c.
    2. Quando o eixo cestiver mais distante do paralelo com a luz incidente e o cristal de gelo é girado entre as polaroides cruzadas, a luz transmitida alternará entre 0-100% de transmissão a cada 90° de rotação do cristal.
    3. Mais comumente, o eixo cserá normal ao plano circular do cristal cilíndrico de gelo.
  3. Determine a orientação dos eixosa por gelo colocando25, o que é feito embrulhando o cristal de gelo firmemente em papel alumínio, cutucando um pequeno buraco com uma agulha através da folha no gelo no plano basal (normal ao eixo c),e colocando-o sob vácuo por 20 minutos.
    1. Este tratamento produzirá uma gravação com simetria hexagonal no plano basal, onde os eixos acorrem através dos vértices da estrela de seis lados (Figura 2A).
    2. Se desejar, o cristal de gelo pode ser cortado com uma serra paralela ou perpendicular a um lado do hexágono para montá-lo com um plano prisma primário ou secundário perpendicular ao dedo frio, respectivamente (Figura 3).

3. Adsorção de Proteínas anticongelantes fluorescentes rotuladas para um único cristal de gelo

  1. Monte um único cristal de gelo sobre o dedo frio (Figura 1C) primeiro entediando uma cavidade no topo do cristal. Para isso, alternar derreter o gelo com duas hastes de alumínio de diâmetro ligeiramente diferente, mas semelhante ao diâmetro do dedo frio, para formar a cavidade em que o dedo frio pode caber.
  2. Esfrie o dedo frio a -0,5 °C, coloque na cavidade de gelo e mantenha o cristal de gelo no lugar até congelar até congelar até o metal (Figura 2B). Evite bolhas de ar ao fixar o cristal no dedo, pois elas dificultam a transferência eficiente de calor do dedo para a haste.
  3. Encha um copo hemisférico que tenha aproximadamente o dobro do diâmetro do cristal de gelo com água ou tampão desionizado filtrado, resfriado a aproximadamente 4 °C. Submergir o cristal de gelo frio ligado ao dedo no copo e remover o excesso de água ou tampão de tal forma que o topo do cristal de gelo esteja aproximadamente nivelado com a camada líquida e o gelo não esteja tocando as paredes do copo.
    1. Cubra o copo com isolamento e baixe a temperatura para -5 °C.
    2. Aguarde aproximadamente 1 hora para que o cristal de gelo se forme em um hemisfério, verificando seu status aproximadamente a cada 20 minutos (Figura 2C).
    3. O gelo tomará a forma do copo hemisférico derretendo e cultivando o cristal de gelo, mas nunca deve crescer demais para tocar as paredes do copo. Deve haver pelo menos uma distância de 1 cm entre a parede e o hemisfério e o dedo frio não deve se projetar do gelo.
  4. Retire o copo do cristal de gelo e adicione a solução de proteína fluorescente a um volume final de 25-30 ml e concentração de análise desejada, tendo o cuidado de manter o volume líquido total no copo inalterado. Uma concentração típica da AFP é de 0,1 mg/ml.
    1. Resubmergar o cristal de gelo no copo para que o topo do cristal de gelo esteja nivelado com o líquido e o cristal de gelo não toque nas paredes do copo (Figura 2D).
    2. Solte a temperatura do dedo frio para -8 °C e deixe a solução de proteína congelar no cristal de gelo por 2-3 horas, agitando a solução com frequência. O gelo formado a partir da solução proteica deve ser de pelo menos 5 mm antes de parar o crescimento do gelo.
  5. Retire o cristal de gelo do copo enquanto ainda estiver preso ao dedo frio. Retire o gelo deste último aquecendo o refrigerante através do dedo frio para pouco mais de 0 °C e espere até que o cristal de gelo derreta.
  6. Coloque o lado plano de cristal para baixo sobre uma superfície limpa, como um prato de pesagem, tomando cuidado para não tocar no gelo recém-formado e armazenar a -20 °C por pelo menos 20 minutos antes de entregar.

4. Visualização de planos de gelo ligados à proteína anticongelante

  1. A visualização da fluorescência é feita em um congelador escurecido ou sala fria, colocando o fundo de cristal de gelo para baixo sob lâmpadas com filtros de excitação específicos de comprimento de onda para excitar o rótulo fluorescente e filtros de emissão da câmera para bloquear qualquer outra luz inespecífica. Com base no padrão, os planos de gelo que são vinculados por AFPs podem ser estimados (Figura 4).
  2. Se as luzes específicas do comprimento de onda não estiverem disponíveis, uma caixa de luz UV pode ser usada em vez disso.
  3. As etches de gelo tradicionais também podem ser realizadas simplesmente permitindo que o hemisfério de gelo sublimar a -20 °C por pelo menos 3 horas, após o qual o pó de proteína residual pode se tornar visível na superfície do gelo (Figura 5).
  4. O passo 2.3 pode ser repetido para determinar a orientação dos eixosa do hemisfério de gelo completo.

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Resultados

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A preparação e a montagem do cristal de gelo único são as duas etapas do procedimento FIPA onde os erros são mais comumente cometidos. Determinar se o cristal de gelo preparado é único é feito examinando-o através de polaroides cruzadas (Figura 1D), conforme descrito na etapa 2.1 da seção de protocolo. Se um cristal de gelo multicristalino for usado para a análise FIPA, o resultado será a vinculação descontínua dos AFPs no hemisfério sem um padrão de ligação coerente (Figura 6B). Se as i...

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Discussão

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Desenvolvimento do método de gravação de gelo por Charles Knight para determinação de aviões de gelo ligados à AFP estudos muito avançados sobre o mecanismo de ligação de gelo por AFPs. Considerando que as estruturas de AFPs poderiam ser resolvidas pela cristalografia de raios-X26,27, não havia um método óbvio para deduzir a superfície complementar no gelo a que a AFP se ligava. Quando o tipo I AFP do flounder de inverno foi inicialmente caracterizado, foi hipótese para se ligar aos planos principais de prisma...

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Divulgações

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Nenhum conflito de interesses declarado.

Agradecimentos

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A PLD ocupa a Cadeira de Pesquisa do Canadá em Engenharia de Proteínas. Este trabalho foi financiado por uma bolsa dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde para a PLD. Este trabalho também foi apoiado por um Grant-in-Aid para pesquisas científicas da Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (nº 23310171) e da Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Somos gratos aos Drs. Chris Marshall e Mike Kuiper pelo trabalho pioneiro que levou à FIPA. Também agradecemos ao Dr. Sakae Tsuda por fornecer instalações para alguns deste trabalho e à Dra.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
NESLAB RTE Banho/Circuladores RefrigeradoresThermo ScientificRTE7
Etilenoglicol, Anticongelante/Refrigerante Pré-misturadoCertificado29-3037-0Anticongelante automotivo comum
Dedo frionão disponívelnão disponívelFeito sob medida com latão (9 cm de comprimento, 1,5 cm de diâmetro externo)
Copo hemisfériconão disponívelnão disponívelFeito sob medida com resina (8 cm de diâmetro externo, 6 cm de diâmetro interno)
Sistema de Iluminação de Alta Saída DuplaLightools ResearchLT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FXFiltros de excitação adicionais e personalizados podem ser adquiridos na Câmera de Pesquisa Lightools Filtros de
CanonEOS 50D
Lightools ResearchLT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVGPode ser necessário um adaptador de anel de filtro para encaixar o filtro na lente da câmera
Emissão

Referências

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