Bottom-up e espingarda Proteômica para Identificar um Comprehensive Coclear Proteome

Resumo

Análise do proteoma do epitélio sensorial da cóclea pode ser um desafio, devido ao seu pequeno tamanho e porque as proteínas da membrana são difíceis de isolar e identificar. Tanto a membrana e proteínas solúveis podem ser identificados através da combinação de vários métodos de preparação e de técnicas de separação junto com espectrometria de massa de alta resolução.

Resumo

Proteômica é uma abordagem comumente utilizado, que pode fornecer insights sobre sistemas biológicos complexos. O epitélio sensorial da cóclea contém receptores que transduzem a energia mecânica do som para uma energia electro-química processada pelos sistemas nervosos periférico e central. Diversas técnicas têm sido desenvolvidas proteomic para estudar o ouvido interno da cóclea, tais como electroforese bidimensional em gel de diferença (2D-DIGE), anticorpo do microarray, e espectrometria de massa (MS). MS é a ferramenta mais abrangente e versátil em proteômica e em conjunto com métodos de separação pode fornecer um proteoma em profundidade de amostras biológicas. Os métodos de separação combinadas com MS tem capacidade para enriquecer amostras de proteína, detectar baixo peso molecular e as proteínas hidrofóbicas, e identificar proteínas abundantes baixas, reduzindo a gama dinâmica do proteoma. Estratégias diferentes de digestão pode ser aplicado a todo o lisado ou lisado de proteína fraccionada para aumentar peptídeo e proteínacobertura seqüência. Utilização de técnicas de separação diferentes, incluindo permuta catiónica forte (SCX), em fase inversa (RP), e electroforese fracção aprisionamento líquido eluído-gel (GELFrEE) podem ser aplicadas para reduzir a complexidade da amostra antes da análise por MS para a identificação das proteínas.

Introdução

Proteomics é o estudo dos sistemas biológicos complexos, analisando a expressão da proteína, função, modificações, e interacções ^1. Vários métodos têm sido utilizados para a análise do proteoma do ouvido interno, incluindo o anticorpo microarray ^2, electroforese em gel bidimensional, ^3-5, e DIGE ^6. No entanto, apenas um número limitado de proteínas foram identificadas e caracterizadas ^2,7-10, em comparação com os 10.000 e os genes marcadores de sequências expressas (ESTs) identificados no ouvido interno, ^11,12, MS é a técnica mais utilizada abrangente e em proteômica para a caracterização de proteínas.....

Protocolo

Declaração de Ética

Experimentos utilizando tecido camundongos foram aprovados pela University of South Florida Animal Care Institucional e Comitê de Uso (Protocolos 3931R, 3482R), conforme estabelecido sob as diretrizes do National Institutes of Health.

1. Extração de Proteína

1. Isolar epitélio sensorial da cóclea de 16 em 30 dias de idade (P30) camundongos CBA / J e armazenar a -80 ° C.
2. No dia da experiência, lavar o tecido com 500 ul de 1x tampão de fosfatos salino (PBS). Centrifugar durante 3 min a 1000 xg, e remover o sobrenadante. Repetir para um total de três lavagens.
3. Tecido S....

Resultados

Para obter o proteoma mais abrangente do epitélio sensorial da cóclea, a dissecção do tecido rápida é necessária antes da extração de proteínas e de preparação da amostra. Duas técnicas proteômicas pode ser usado, de espingarda e bottom-up proteômica. Para preparar amostras para proteómica espingarda, procedimento de digestão FASP foi utilizado como ilustrado na Figura 1. O método permite que FASP para concentração de proteínas, a remoção de detergentes, e a digestão de proteínas, utilizando várias enzi.......

Discussão

Os principais passos para maximizar a identificação de proteínas do epitélio sensorial da cóclea são: 1) uso de múltiplos endoproteinases para a digestão, 2) utilização de múltiplas técnicas de separação, e 3) a utilização de um espectrômetro de massa de alta resolução. A aplicação de enzimas múltiplas aumenta o número de péptidos e melhora a cobertura da sequência de proteína, portanto, melhorar o número de proteínas identificadas a partir do tecido da cóclea. Tripsina, a protease mais utilizada fornece clivagem .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cartucho de trisacetato 8%	Descoberta de Proteína	42103
Acetona	Sigma-Aldrich	179124
Acetonitrila	Honeywell	015-1L
AEBSF	Calbiochem	101500
Formato de amônio	Fisher Scientific	AC16861
Aprotinin	Calbiochem	616370
ASB-14	Calbiochem	182750-5GM
Albumina de soro bovino	BioRad	500-0112
C18 coluna	Novo objetivo	A25112	75 μ m x 10 cm
Ensaio de Proteína DC	BioRad	500-0116	Microplate Protocolo
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Endoproteinase Lys-C	Sigma-Aldrich	P3428
FASP Kit de Digestão de Proteínas	Descoberta de Proteínas	44250
Ácido fórmico	Fluka	94318
GELFrEE Sistema de Fracionamento	Descoberta de Proteínas	42001	GELFrEE 8100
Leupeptina	Calbiochem	108975
Coluna MacroSpin	The Nest Group	SMM SS18V	Sílica C18
Microcistina	Calbioquímica	475815
Pestatina	Sigma-Aldrich	P5318
Coluna Polysulfoethyl A	The Nest Group	202SE0503
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sonic Dismembrator	Thermo Fisher	15-338-53	Modelo 100
Tripsina	Sigma-Aldrich	T6567	Grau de Proteômica