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Artigo de método

Isolamento de duplas Células αβ T negativa do Rim

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DOI:

10.3791/51192

⸱

16 de maio de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

Neste artigo

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Resumo

DNabT células são raras entre as células T periféricas; no entanto, eles são abundantes em certos tecidos não linfóides. Dificuldade de isolar as células T DN a partir de tecidos não-linfóides dificulta a sua análise funcional, apesar do aumento reconhecida importância fisiopatológica. Descreve-se um novo protocolo para o isolamento de células altamente purificadas DN T de rim murino.

Resumo

Não existe actualmente nenhum protocolo padrão para o isolamento de células T DN dos tecidos não linfóides apesar do seu envolvimento cada vez relatada em diversas respostas imunitárias. DN células T são um tipo de células imunitárias única que tem sido implicado na regulação de respostas imunes e tolerância e auto-imunes a alotransplante 1-6. Células T DN são, no entanto, raro no sangue periférico e órgãos linfóides secundários (baço e linfonodos), mas são os principais habitantes do rim normal. Muito pouco se sabe sobre sua função fisiopatológica 7, devido à sua escassez na periferia. Recentemente, descreveu uma análise fenotípica e funcional abrangente desta população no rim 8 em estado estável e durante a isquemia reperfusão. Análise da função das células T DN será consideravelmente reforçada através do desenvolvimento de um protocolo para o isolamento do rim.

Aqui, descrevemos um novo protocolo que permite isolation de células altamente puros ab CD4 + CD8 + T e células T DN do rim murino. Resumidamente, podemos digerir tecido renal utilizando colagenase e isolamento de células mononucleares de rim (KMNC) por gradiente de densidade. Isto é seguido por dois passos para enriquecer as células T hematopoiéticas de 3% a 70% de KMNC. A primeira etapa consiste de uma selecção positiva de células hematopoéticas CD45 + usando um kit de isolamento. No segundo passo, as células T são DN negativamente isolado por remoção das células não desejadas usando CD4, CD8, e anticorpos monoclonais de MHC de classe II e CD1d α-GalCer tetrâmero. Esta estratégia conduz a uma população de mais do que 90% de células T DN puros. Coloração de superfície com os anticorpos acima mencionados, seguida por análise FACS é usado para confirmar a pureza.

Introdução

Peripheral αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - double-negativo células (DN) T são divididos em vários subgrupos que possuem fenótipos e funções 1-4 distintas. DN células T são pouco compreendidos mas cada vez mais a ser implicadas nas respostas imunes fisiopatológicas em diferentes modelos de doença 4-6.

Células DN T são um tipo de célula imunológica única que é cada vez mais implicados na regulação de várias respostas imunes e auto-imunes ea modulação da tolerância alotransplante. 4-6, 9 Eles são raros no sangue periférico e órgãos linfóides secundários (baço e linfonodos ). No entanto, eles são os principais moradores do rim e intestino epitélio normal 10-12. Muito pouco se sabe sobre sua função 7 no rim no estado estável e em condições patológicas como lesão renal aguda (LRA), associados com transpl renalformiga.

Devido às funções complexas de células imunes diferentes na regulação de respostas imunes, incluindo alloresponses, a definição do papel de cada jogador é fundamental na compreensão alloresponses e concepção de novas terapias. Dado o número significativo de células T DN presentes no rim em condições fisiológicas e de doenças diferentes, as células T DN são susceptíveis de desempenhar um papel crítico na regulação das respostas imunológicas e auto-imunes em ratos e seres humanos, e alloresponses em receptores de transplante. Acumulando embora a evidência ainda espalhados implica células T DN em ambas as funções patogênicos e imunossupressores, mas é mal compreendido por que e como eles exibem uma função prejudicial ou supressiva específico e como o ambiente influencia-los.

Devido à sua fraca abundância no rim, métodos melhorados de isolamento são necessárias.

Não há atualmente nenhum protocolo padrão para isolamento de células T DN de the tecidos não linfóides. Nosso protocolo descreve um novo método para o isolamento de células T DN do rim; No entanto, o método também pode ser utilizado para vários tecidos não linfóides.

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Protocolo

1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura e Reagentes

  1. Instrumentos: Preparar os reagentes em condições estéreis e usar em uma capela de fluxo laminar.
  2. Prepare 1 litro de meio de cultura RPMI tecidos, adicionam-se 5% de soro fetal bovino, 2,1 g de bicarbonato, 10 ml de glutamato de 100 vezes, 10 mg de HEPES, piruvato de sódio 1 mg e 10 ml de 100x de penicilina / estreptomicina.
    Nota: o meio de cultura de tecidos recomendados, RPMI, é intercambiável com DMEM.
  3. Preparar a solução de 5% de colagenase "D" (5 ml de colagenase "D" a 9 ml de meio de cultura de tecido).
  4. Adicione uma solução de Percoll a três concentrações diferentes: 100%, 80% e 40%. As seguintes concentrações são calculados para um amostra. Manter as soluções à temperatura ambiente.
    1. Solução de Percoll: adicionar 9 ml de Percoll (não diluído de solução estoque); adicionar 1 ml de PBS 10x.
    2. Solução de Percoll: adicionar 8 mL de Percoll a 100%; adicionar 2 ml de PBS 1x.
    3. Solução de Percoll:adicionar 4 ml de Percoll a 80%; adicionar 4 mL de PBS 1x.
  5. Adicione 1 L de células activadas por fluorescência tampão (FACS); adicionar 5 ml de 10% BSA (0,1% BSA), azida de sódio a 1 ml a 10% (0,1%), 2 ml agente EDTA, fazer até 1.000 ml com PBS 1x.

2. Preparação de rim Digestão

  1. Tendo adquirido qualquer aprovação institucional necessário, sacrificar e desangrar os ratos com métodos padronizados e seguindo as normas vigentes e orientações de cuidados de animais.
    1. Anestesiar o mouse com pentobarbital (0,07 mg / kg).
    2. Vá para a sangria.
    3. Posicione o mouse em decúbito dorsal sobre uma mesa cirúrgica.
    4. Pulverizar a área abdominal com etanol a 70%.
  2. Adicionar 10 ml de solução de colagenase D para a placa de Petri.
  3. Retire e decapsulate ambos os rins de cada rato.
    1. Abrir a cavidade abdomimal fazendo uma incisão na linha média abdominal através da pele e do peritoneu do esternoo púbis.
    2. Expor o rim esquerdo movendo o intestino lateralmente para o lado.
    3. Cuidadosamente deixou separar a cápsula com a pinça.
      Nota: A cápsula aparece como uma camada transparente em torno do rim e parcialmente coberta por tecido adiposo perirrenal.
    4. Remover o rim esquerdo cortando os vasos do pedículo usando uma tesoura cirúrgica.
    5. Repita o mesmo procedimento para o rim direito.
      Nota: O rim direito é mais cranial e mais perto da linha média (pedicelos são mais curtas).
  4. Coloque o rim para a placa de Petri.
  5. Cortar o tecido renal em pedaços pequenos (1-2 mm de dimensão) usando uma lâmina de moldagem de metal regular e colocar as peças na solução de colagenase durante 30-45 minutos na incubadora a 37 ° C (Figura 1).

3. Preparação de células mononucleares do rim (KMNC) da Digestão rim

  1. Se obter uma suspensão de células do rimdigestão por disrupção mecânica do tecido com um filtro (70 mm) e ressuspender em 25 ml de meio de cultura de tecidos e misturar.
  2. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar a suspensão de células.
  3. Re-suspender o sedimento em 4 ml de solução de Percoll a 40% e suavemente sobrepor em 4 ml de uma solução de Percoll a 80% com uma pipeta de transferência de plástico, muito lentamente e cuidadosamente. Isto irá resultar em duas fases claramente separadas por uma camada translúcida. Na parte superior vai ser uma camada amarela correspondente aos lípidos.
  4. Centrifugar a 1.500 xg durante 30 minutos à temperatura ambiente com a centrífuga no freio modo.
  5. Remover por aspiração a camada superior amarela e espessa (cerca de 1-2 ml).
  6. Recolhe apenas uma ligeira camada translúcida esbranquiçado a partir da interface das duas fases, com uma pipeta de transferência. Transferir muito cuidadosamente esta suspensão em um tubo de 15 ml contendo 2 ml de meio de cultura de tecido e, em seguida, adicionar 13 ml de meio para perfazer um volume total de15 ml.
  7. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C.
  8. Ressuspender as amostras em 1 ml de meio.
  9. Contar o número de KMNC usando exclusão com azul de tripano em um hemocitómetro e exprimir os resultados como o número de KMNC por ml por rim.
  10. Lavar uma vez como acima.

4. Isolamento de hematopoiéticas (CD45 +) Células de KMNC (Passo I)

  1. Ressuspender as células até 10 7 em 90 ul de tampão de corrida.
  2. Adicionar 10 ul de microesferas de CD45 e incubar durante 15 min a 4 ° C.
  3. Adicionar 1 ml de tampão de corrida para parar a reacção. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender em 500 ul de tampão de corrida.
  4. Prepare a coluna magnética, colocando no ímã e enxágüe com 3 ml de tampão de corrida.
  5. Passar a suspensão de células através de uma coluna magnética e recolher as células não marcadas que passam através da coluna.
  6. Lave as células três vezes com 3 ml de runnção tampão. Em seguida, coletar o efluente.
  7. Remova a coluna do separador e pipeta de 5 ml de tampão de corrida para as colunas e expulsar a fração rotulado imediatamente. Esta fracção contém as células CD45 +. Contar as células.
  8. Para calcular o número absoluto de células T diferentes subconjuntos em rins multiplicar o número total de KMNC pela percentagem de células positivas determinada por citometria de fluxo (Figura 2).

5. Isolamento de DN celular T de CD45 + Preparação de selecção negativa (Etapa II)

  1. Adicionar 2,5 mL (0,5 mg / mL, 1,25 ng) de cada um dos seguintes: anticorpos biotinilados anti-CD4, anti-CD8, anti-receptor de Fc (CD16/32), anti-MHC classe II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetrâmero para cada 10 células hematopoiéticas 7.
  2. Incubar as células durante 30 minutos em câmara fria.
  3. Adicionar 1 ml de microesferas anti-biotina.
  4. Incubar durante 30 minutos numa sala fria.
  5. Colocar o tubo no tele ímã e proceder ao esgotamento.
  6. Contagem de células viáveis ​​para determinar o número total de células T DN na fracção negativa, utilizando um hemocitómetro.
  7. Verifique a pureza das células T DN com citometria de fluxo, seguindo esta estratégia de propagação: primeiro portão CD45 +, segundo portão TCRαβ +. Excluir células CD1d +. Lote T CD4 + contra CD8 + para identificar células DN T (Figura 3).
  8. Multiplicar o número total determinado pela percentagem em pureza.
    Nota: O uso deste protocolo resulta em uma população de mais de 90% de células T DN puros.

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Resultados

Tipo selvagem C57BL / 6 (B6) rim contém aproximadamente 1,5-2,1 x 10 6 células mononucleares por rim. Cerca de menos de 10% são células hematopoiéticas CD45 +. Para a preparação de células mononucleares do rim (KMNC), os rins são cortadas em pedaços pequenos, como mostrado na Figura 1 seguido por digestão usando 5% de colagenase.

Isto é seguido por realização de uma centrifugação de gradiente de densidade para recolher camada KMNC (Figura 2, pai...

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Discussão

Há cada vez mais interesse em células T DN, uma vez que estão sendo implicados em diferentes condições patológicas, como doenças auto-imunes, câncer, tolerância enxerto e doenças primárias do rim, incluindo lesão renal aguda (LRA), glomerulonefrite 8, 13. Portanto, há necessidade de melhor compreender e caracterizar as funções fisiopatológicos de células T DN. No entanto, atualmente há uma falta de compreensão da função dessas células, em comparação com CD4 e células T CD8. Uma das principais razões é escasse...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pelo NIH PBS (R21 AI095484). Agradecemos NHI tetramer instalação do núcleo para CD1d tetrâmero.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Capuz de fluxo laminar Baker Company, IncOu equipamento equivalente 
CentrífugaBeckman CoulterOu equipamento equivalente 
HemocitômetroMicroscopia Eletrônica Sciences63514-11
Incubadora controlada por atmosferaFisher Scientific ( 37 &graus; C com 5% de CO2)
Citômetro de fluxo analíticoLSR II
RPMI 1640Media Tech10-040-CV
Colagenase DRoche11088858001
Percoll GE Healthcare17-0891-01
Soro fetal bovinoCorning Cellgro35-011-CV
0.1% azida de sódio (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Tampão fosfato tampão salino (PBS)Corning Cellgro21-040-CV
PBS 10xMediatech46-013-CM
EDTA buffer Colunas Sigma-AldrichE1161
LS MiltenyiBiotec130-042-401
Microesferas CD45+ MicroesferasMiltenyiBiotec6.78E-51
 MiltenyiBiotec130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP eBioscienceG1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7Biolegend103116
anti-TCR Azul Pacífico  (ab-cadeia, clone: H57-597)InvitrogenHM3628
anti-CD4 PEeBioscience12-0043
anti-CD8 FITCeBioscience8011-0087
anti-CD4 biotinilado (GK1.5)BD553728
anti-CD8 biotinilado  (clone 53-6.7)BD553029
anti-MHC CLASSE II (I-A b) biotiniladaBD553609
AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer MIlteny I Biotec130-091-221
C57BL/6J camundongosJackson Labs000664Rins - Placa de Petri para Linfonodos
 BD Biosciences356517
70 μ Filtro M Fisher Scientific22363548
Êmbolo Ou equipamento equivalente 
Tubos GeneMate 50 mlBioexpressC-3394-3Ou equipamento equivalente 
Tubos GeneMate 15 mlBioexpressC-3394-1Ou equipamento equivalente 
CD1d α-galcer tetrâmeroNHI
de Biotina

Referências

  1. Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
  2. Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
  3. Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
  4. Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
  5. Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
  6. Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
  7. Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
  8. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
  9. Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
  10. Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
  11. Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
  12. Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
  13. Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
  14. Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
  15. Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
  16. Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
  17. Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).

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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

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Células Mononucleares do RimDigestão com ColagenaseCentrifugação por Gradiente de DensidadeSeleção Positiva de CD45Seleção NegativaAnálise por Citometria de FluxoSeparação por Esferas MagnéticasEnriquecimento de Células HematopoiéticasIsolamento de Rim Murino
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