Um ensaio ovo-in-worm (EIW) é um método útil para quantificar o comportamento de postura. Alterações na postura de ovos pode ser uma resposta comportamental do organismo modelo<em> Caenorhabditis elegans</em> A substâncias ambientais potencialmente prejudiciais, tais como os produzidos por bactérias patogénicas.
C. elegans comportamento de postura de ovos é afetado por estímulos ambientais, como a osmolaridade 1 e vibração 2. Na ausência total de alimentos C. elegans também deixará postura de ovos e manter ovos fertilizados em sua 3 útero. No entanto, o efeito de diferentes fontes de alimentos, especialmente bactérias patogénicas e, particularmente, Enterococcus faecalis, sobre o comportamento de postura não está bem caracterizado. O ensaio in ovo sem-fim (EIW) é uma ferramenta útil para quantificar os efeitos de diferentes tipos de bactérias, neste caso E. faecalis, sobre o comportamento de postura.
EIW ensaios envolvem a contagem do número de ovos retidos no útero de C. elegans 4. O ensaio EIW envolve branqueamento encenado, grávida adulto C. elegans para remover a cutícula e separar os ovos retidos do animal. Antes do branqueamento, os vermes são expostos a bactérias (ou qualquer tipo de sinalização ambiental) Por um período fixo de tempo. Após o branqueamento, é muito facilmente capaz de contar o número de ovos retidos no interior do útero dos vermes. Neste ensaio, a um aumento na retenção quantificável de ovos após E. exposição faecalis pode ser facilmente medido. O ensaio EIW é um ensaio comportamental que poderia ser utilizado para rastrear para bactérias potencialmente patogénicos ou a presença de toxinas ambientais. Além disso, o ensaio EIW pode ser uma ferramenta para o rastreio de fármacos que afectam a sinalização de neurotransmissores, pois o comportamento de postura é modulada por neurotransmissores, tais como serotonina e acetilcolina 5-9.
Caenorhabditis elegans, um microscópico, lombriga de vida livre, é um organismo modelo tradicionalmente usado para estudar os processos de desenvolvimento e de sinalização celular por causa de sua anatomia transparente, o desenvolvimento bem caracterizada, totalmente sequenciado o genoma, em tempo de geração curto, e homologia genética de seres humanos . Mais recentemente, C. elegans tornou-se um organismo modelo no campo da toxicologia ambiental e imunidade inata 10, 11.
Esses vermes hermafroditas auto-fertilização se tornam sexualmente maduros dentro de dois a três dias de incubação do ovo. Durante o seu ciclo de vida, C. elegans passa por quatro estágios larvais (L1-L4), antes de atingir a idade adulta. Um isolado hermafrodita pode produzir, em média, 300 filhotes dentro de três dias de pico de fecundidade. Em reprodutivamente madura C. elegans hermafroditas, os ovos fertilizados são retidos no interior do útero durante várias horas antes de ser colocada. Onúmero normal de ovos armazenados no útero em qualquer momento (durante o pico da fecundidade) situa-se entre dez e quinze 12. O número de ovos no útero é uma função de ambos, a taxa de produção de ovos e a taxa de postura de ovos. Os ovos fertilizados são expulsos do útero pela contração da musculatura dezasseis vulvares dispostas em torno da abertura da vulva 13. Neurónios motores específicos do hermafrodita (do HSN) e neurónios motores VC sinapse para os músculos da vulva que afetam a contração muscular e, assim, postura comportamento 5,7,13,14. Expulsão dos ovos do útero ocorre devido à atividade coordenada de neurônios e músculos.
Culturas de laboratório de C. elegans normalmente são levantadas em uma dieta de não patogênicas de Escherichia coli OP50. No ambiente natural, C. elegans entrar em contacto com uma variedade de fontes de alimentos, tais como as bactérias patogénicas, que podem ser potencialmente prejudiciais. Quando expostos a substâncias nocivas emambiente, C. elegans reter ovos até que o ambiente torna-se mais favorável. Presumivelmente, esta retenção de ovos é um esforço para proteger sua prole.
Neste verme ovo em ensaio (EIW), C. elegans estão expostos às bactérias potencialmente patogénicas, Enterococcus faecalis, que é encontrada no meio ambiente. A exposição a formas patogénicas de E. faecalis pode causar infecção intestinal persistente e até mesmo a morte em C. elegans 15. A exposição a outras formas de bactérias patogénicas têm demonstrado afectar a retenção de ovo 16,17, no entanto, o efeito não foi quantificado. Além disso, o efeito de suavemente estirpes patogénicas de E. faecalis, as estirpes que não são imediatamente letal, sobre o comportamento de postura não foi estudado.
EIW ensaios envolvem a contagem do número de ovos retidos no útero de C. elegans 4. Embora C. eleganssão transparentes, os ovos que se acumulam no útero pode ser difícil de quantificar num animal intacto. O ensaio EIW envolve branqueamento gravídico adulto C. elegans que foram expostos a bactérias, por um período fixo de tempo. A solução de água sanitária dissolve a cutícula externa deixando os ovos para trás. Os ovos são de refracção para os efeitos de branqueamento, devido à presença de uma casca de ovo. Após o branqueamento, é muito facilmente capaz de contar o número de ovos libertados do útero dos vermes após o branqueamento.
O ensaio é descrito um método simples, barato e rápido para quantificar o número de óvulos no útero de uma só vez, e, assim, quantificar os efeitos de E. faecalis sobre retenção de ovo. Este ensaio pode ser utilizado para quantificar o efeito de outros tipos de bactérias, toxinas ou medicamentos ambientais sobre a retenção de ovo. Este ensaio tem também o potencial de ser usada como uma tela para patogenicidade.
1) Elaboração de Nematóides Crescimento Mídia (NGM)
2) Preparação de B Caldo E. Mídia coli
3) Sementeira C. elegans Placas de Manutenção
4) A manutenção C. elegans Cepas
5) Preparação de Tryptic Soy Agar (TSA), E. faecalis Meios de Cultura
6) Preparação de Tryptic Soy Broth (TSB), E. faecalis Meios de Cultura
7) Preparação de Heart Infusion (BHI) Mídia Cérebro, com estreptomicina, para E. faecalis Cultura
8) Mantendo E. faecalis Cepas
9) Preparar E. Placas faecalis para EIW Assay
10) Preparar E. Placas coli para EIW Assay (placas de controlo)
11) Ovo em Ensaio Worm
Os passos mais importantes na realização com êxito neste ensaio são os seguintes: 1) usando stocks bem alimentados de C. elegans, 2) cultura de tipos individuais de bactérias na placa de ensaio, 3) identificação precisão encenado L4 vermes para a exposição a E. faecalis, 4), mantendo o tempo de exposição a E. faecalis consistentes em todos os ensaios e 5) branqueamento tempo não deve exceder 10 minutos para impedir a desintegração do ovo.
Para este ensaio, é importante escolher saudáveis, bem alimentados vermes. Inanição materna pode afectar o crescimento de fecundidade e progenitura 19,20, portanto, é importante que os vermes foram bem alimentados durante várias gerações antes de executar este ensaio. Um estoque bem alimentado de vermes é de fácil manutenção, basta transferir alguns vermes adultos para uma nova placa NGM semeado a cada 2-3 dias. Dois dias antes do ensaio, os vermes adultos devem ser colocados em uma de OP50 relva fresca, a fim de ter suficiente L4 progenitura disponíveis para o ensaio.
<classe p = "jove_content"> É também importante que as chapas de ensaio EIW promover o crescimento de um único tipo de bactérias. E. faecalis estirpes foram cultivadas em placas de BHI. Estreptomicina foi adicionado às placas para seleccionar contra E. coli OP50, que é transferido com as L4 vermes como eles são transferidos de placas NGM manutenção para as placas de ensaio. OP50 também cresce em placas de BHI. Se não for selecionado contra, C. elegans que se alimentam de dois tipos de bactérias (E. coli e E. faecalis), enquanto que nas placas de BHI. As estirpes de E. faecalis usados neste ensaio são resistentes à estreptomicina. Se foram utilizados diferentes tipos de bactérias para este ensaio, um antibiótico diferente, e talvez em diferentes meios de cultura, devem ser utilizados para seleccionar as bactérias de escolha e contra E. coli OP50.Seleccionar vermes precisão encenado para este ensaio é crucial, por diversas razões. Em primeiro lugar, é importante contar com a retenção de ovo durante t ele tempo de produção de ovos / postura na C. auto-fertilização elegans. A produção de ovos ocorre apenas durante os primeiros cinco dias de C. elegans idade adulta (com um pico de cerca de 40 horas após a L4) e declina rapidamente depois 4,21. Os vermes adultos vivem em média de duas a três semanas, tantos vermes adultos vivem por pelo menos uma semana, enquanto não produzir ovos fertilizados. Portanto, é importante ter a certeza que o ensaio EIW não é executada em vermes adultos unstaged de idade desconhecida.
A segunda razão, é importante o uso de animais encenado no ensaio EIW é de modo a que o tempo de desenvolvimento no qual os vermes terem sido expostos à bactéria, toxina ou fármaco é rigorosamente controlada. Culturas de C. elegans são normalmente sincronizadas para o ovo, L1 ou L4 fases. A fase L4 foi utilizado para este ensaio por causa da preocupação de que uma exposição mais longa de E. faecalis resultaria em letalidade antes de vermes adultos tornou-se grávidas.
tenda "> A duração do tempo de vermes são deixados na solução de branqueamento é também importante controlar. Worms normalmente deve dissolver-se em menos de dez minutos, embora este tempo varia de verme de verme. ovos fertilizados são eventualmente dissolvido por água sanitária, mas o processo de é mais lento do que para a cutícula, devido à presença de uma casca de ovo. casca do ovo começará a ser dissolvida pela água sanitária se deixado em solução durante mais de 10-15 minutos.Retenção de ovos reflete o equilíbrio entre a produção de ovos e postura de ovos. O ensaio EIW sozinho não distingue se o número de ovos retidos no útero é devido a alterações na produção de ovos ou de postura de ovos. Isto é especialmente uma preocupação se vermes tratados com uma estirpe bacteriana ou toxina reter menos ovos do que aqueles no grupo de controle. Nestes casos, especialmente, um ensaio tamanho da ninhada follow-up deve ser feito. Ensaios tamanho da ninhada quantificar o número de ovos colocados ao longo da vida reprodutiva 4 do worm </sup>. Se o tamanho da ninhada de vermes nos grupos experimental e controle são as mesmas, então as diferenças na retenção de ovo pode ser atribuída a diferenças no comportamento de postura de ovos. Como é improvável que levemente estirpes patogénicas bacterianas como E. faecalis iria actuar para aumentar a produção de ovos, é razoável supor que um aumento da retenção de ovos após a exposição a E. faecalis (como visto na Figura 3) é um resultado da diminuição do comportamento de postura de ovos.
O ensaio também não EIW determinar o mecanismo através do qual as bactérias podem alterar a retenção de ovo. É possível que a C. elegans pode reter os ovos, pois as bactérias patogênicas afeta alimentação colonizando e bloqueando a abertura da boca ou porque é uma fonte de alimento pobre. Também é possível que as bactérias podem colonizar e bloquear a abertura da vulva, ou afectar a função das células do sistema oviposição. Uma análise adicional é necessário para determinar o mecanismo através do which retenção ovo é alterada.
Este ensaio EIW pode ser facilmente modificado para determinar os efeitos de diversos tipos de compostos na retenção de ovos. Além disso, este ensaio é suficientemente simples que pudesse ser incorporada uma tela para identificar genes, quer no hospedeiro (C. elegans) ou o agente patogénico (E. faecalis), exigido para o efeito do agente patogénico. O ensaio EIW também pode ser usado para o rastreio de genes necessários para a regulação da postura em si. C. elegans comportamento de postura de ovos é modulado por neurotransmissores como a serotonina e acetilcolina 5-9, e requer a atividade coordenada de vários neurônios e grupos musculares 12. EIW ensaios têm sido e continuam a ser utilizados para identificar genes importantes para a sinalização de neurotransmissores e / ou a actividade muscular. EIW ensaios fornecem um quantitativo, ao invés de qualitativa, a análise de uma importante C. elegans comportamento.
The authors have nothing to disclose.
Agar, ultrapure | Affymetrix | 10906 | |
Bacto Peptone | Becton Dickinson | 211677 | |
Bacto Tryptone | Becton Dickinson | 211705 | |
Brain Heart Infusion dehydrated medium | Carolina Biological Supply | 781781 | |
<em>C. elegans</em>, N2 strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
Culture plates for <em>C. elegans</em> | Tritech Research Inc. | T3308 | |
Culture plates for <em>E. faecalis</em> | Fisher Scientific-Fisherbrand | 875713 | |
<em>E. coli </em>(OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
<em>E. faecalis</em> strains | provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci | ||
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth; | |||
<p>all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified <span style="line-height: 1.6em;">dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars </span><span style="line-height: 1.6em;">(arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed </span><span style="line-height: 1.6em;">presumptive identification of all <em>E</em>. <em>faecalis</em> strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP </span><span style="line-height: 1.6em;">and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains </span><span style="line-height: 1.6em;">were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).</span></p> | |||
Microscope | Motic | SMZ 168B | any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient |
Streptomycin sulfate | Fisher BioReagents | BP910-50 | |
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco | Becton Dickinson | 236950 | |
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL | Becton Dickinson | 211768 | |
Yeast extract | Acros | 61180-1000 |