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Summary

Um ensaio ovo-in-worm (EIW) é um método útil para quantificar o comportamento de postura. Alterações na postura de ovos pode ser uma resposta comportamental do organismo modelo<em> Caenorhabditis elegans</em> A substâncias ambientais potencialmente prejudiciais, tais como os produzidos por bactérias patogénicas.

Abstract

C. elegans comportamento de postura de ovos é afetado por estímulos ambientais, como a osmolaridade ¹ e vibração ^2. Na ausência total de alimentos C. elegans também deixará postura de ovos e manter ovos fertilizados em sua ³ útero. No entanto, o efeito de diferentes fontes de alimentos, especialmente bactérias patogénicas e, particularmente, Enterococcus faecalis, sobre o comportamento de postura não está bem caracterizado. O ensaio in ovo sem-fim (EIW) é uma ferramenta útil para quantificar os efeitos de diferentes tipos de bactérias, neste caso E. faecalis, sobre o comportamento de postura.

EIW ensaios envolvem a contagem do número de ovos retidos no útero de C. elegans ^4. O ensaio EIW envolve branqueamento encenado, grávida adulto C. elegans para remover a cutícula e separar os ovos retidos do animal. Antes do branqueamento, os vermes são expostos a bactérias (ou qualquer tipo de sinalização ambiental) Por um período fixo de tempo. Após o branqueamento, é muito facilmente capaz de contar o número de ovos retidos no interior do útero dos vermes. Neste ensaio, a um aumento na retenção quantificável de ovos após E. exposição faecalis pode ser facilmente medido. O ensaio EIW é um ensaio comportamental que poderia ser utilizado para rastrear para bactérias potencialmente patogénicos ou a presença de toxinas ambientais. Além disso, o ensaio EIW pode ser uma ferramenta para o rastreio de fármacos que afectam a sinalização de neurotransmissores, pois o comportamento de postura é modulada por neurotransmissores, tais como serotonina e acetilcolina ^5-9.

Introduction

Caenorhabditis elegans, um microscópico, lombriga de vida livre, é um organismo modelo tradicionalmente usado para estudar os processos de desenvolvimento e de sinalização celular por causa de sua anatomia transparente, o desenvolvimento bem caracterizada, totalmente sequenciado o genoma, em tempo de geração curto, e homologia genética de seres humanos . Mais recentemente, C. elegans tornou-se um organismo modelo no campo da toxicologia ambiental e imunidade inata ^{10, 11.}

Esses vermes hermafroditas auto-fertilização se tornam sexualmente maduros dentro de dois a três dias de incubação do ovo. Durante o seu ciclo de vida, C. elegans passa por quatro estágios larvais (L1-L4), antes de atingir a idade adulta. Um isolado hermafrodita pode produzir, em média, 300 filhotes dentro de três dias de pico de fecundidade. Em reprodutivamente madura C. elegans hermafroditas, os ovos fertilizados são retidos no interior do útero durante várias horas antes de ser colocada. Onúmero normal de ovos armazenados no útero em qualquer momento (durante o pico da fecundidade) situa-se entre dez e quinze ^12. O número de ovos no útero é uma função de ambos, a taxa de produção de ovos e a taxa de postura de ovos. Os ovos fertilizados são expulsos do útero pela contração da musculatura dezasseis vulvares dispostas em torno da abertura da vulva ^13. Neurónios motores específicos do hermafrodita (do HSN) e neurónios motores VC sinapse para os músculos da vulva que afetam a contração muscular e, assim, postura comportamento ^5,7,13,14. Expulsão dos ovos do útero ocorre devido à atividade coordenada de neurônios e músculos.

Culturas de laboratório de C. elegans normalmente são levantadas em uma dieta de não patogênicas de Escherichia coli OP50. No ambiente natural, C. elegans entrar em contacto com uma variedade de fontes de alimentos, tais como as bactérias patogénicas, que podem ser potencialmente prejudiciais. Quando expostos a substâncias nocivas emambiente, C. elegans reter ovos até que o ambiente torna-se mais favorável. Presumivelmente, esta retenção de ovos é um esforço para proteger sua prole.

Neste verme ovo em ensaio (EIW), C. elegans estão expostos às bactérias potencialmente patogénicas, Enterococcus faecalis, que é encontrada no meio ambiente. A exposição a formas patogénicas de E. faecalis pode causar infecção intestinal persistente e até mesmo a morte em C. elegans ^15. A exposição a outras formas de bactérias patogénicas têm demonstrado afectar a retenção de ovo ^16,17, no entanto, o efeito não foi quantificado. Além disso, o efeito de suavemente estirpes patogénicas de E. faecalis, as estirpes que não são imediatamente letal, sobre o comportamento de postura não foi estudado.

EIW ensaios envolvem a contagem do número de ovos retidos no útero de C. elegans ^4. Embora C. eleganssão transparentes, os ovos que se acumulam no útero pode ser difícil de quantificar num animal intacto. O ensaio EIW envolve branqueamento gravídico adulto C. elegans que foram expostos a bactérias, por um período fixo de tempo. A solução de água sanitária dissolve a cutícula externa deixando os ovos para trás. Os ovos são de refracção para os efeitos de branqueamento, devido à presença de uma casca de ovo. Após o branqueamento, é muito facilmente capaz de contar o número de ovos libertados do útero dos vermes após o branqueamento.

O ensaio é descrito um método simples, barato e rápido para quantificar o número de óvulos no útero de uma só vez, e, assim, quantificar os efeitos de E. faecalis sobre retenção de ovo. Este ensaio pode ser utilizado para quantificar o efeito de outros tipos de bactérias, toxinas ou medicamentos ambientais sobre a retenção de ovo. Este ensaio tem também o potencial de ser usada como uma tela para patogenicidade.

Protocol

1) Elaboração de Nematóides Crescimento Mídia (NGM)

1. Para fazer com que as placas 50, adicionar 1,5 g de NaCl, 8,5 g Agar ultrapura, e 1,25 g de peptona de um 1 Lflask.
2. Adicionar 487,5 ml de dH ₂ O para o balão. Agite bem para misturar e cobrir abertura do frasco com um pedaço de papel alumínio.
3. Esterilizar a solução por tratamento em autoclave, em condições normalizadas (121 psi, 120 ° C, 20 min.)
4. Deixar a solução arrefecer até 45 ° C num banho de água.
5. Para a solução, adicionar o seguinte na ordem: 500 ul de colesterol a 5 mg / ml de solução (dissolvido em etanol), 500 ul de 1 M de _CaCl2, 500 ul de 1 M de _MgSO4, e 12,5 ml de tampão _KPO4 (54,15 g KH ₂ PO ₄ e 17,8 g de K ₂ HPO ₄ em 500 ml de _dH2O), tal como descrito em ^18.
6. Usando pipetas esterilizadas, adicione 10 ml de solução de agar para cada 60 milímetros de poliestireno placa de Petri. Permitir que os meios de comunicação para solidificar à temperatura ambiente overnight.

2) Preparação de B Caldo E. Mídia coli

1. Para fazer com que cinco culturas de 100 ml, adicionar 5,0 g de Bacto-triptona, 2,5 g de extracto de levedura, 5,0 g de NaCl para uma proveta.
2. Adicionar água destilada estéril para um volume final de 500 ml. Aquece-se a solução sobre uma placa quente, com agitação, até que os solutos se dissolveram.
3. Colocar 100 ml de caldo de B em cinco frascos de vidro (pelo menos, 200 ml de volume).
4. Esterilizar a solução por autoclavagem, em condições normalizadas (121 psi, 120 ° C, 20 minutos).
5. Permitir B caldo de arrefecer até à temperatura ambiente antes do uso.

3) Sementeira C. elegans Placas de Manutenção

1. Depois de permitir que as placas NGM a secar à temperatura ambiente durante pelo menos uma semana, inocular 100 ml de um caldo de cultura B com algumas colónias de E. coli (OP50).
2. Crescer E. coli, a cultura a 37 ° C durante a noite.
3. Pipeta uma ou duas gotas (aproximadamente 10081; l) OP50 de cultura para o centro de cada placa NGM. As placas são geralmente empilhados do lado da tampa para cima. Quando pipetagem (seeding), começam por pipetagem a cultura na placa, na parte inferior da pilha. Trabalhe seu caminho até cada pilha. Tente não mover as placas após a sementeira, porque é importante que a cultura não fique muito perto dos bordos da placa.
4. Permitir que as placas semeadas a secar à temperatura ambiente durante pelo menos uma semana antes da utilização.
5. Placas semeadas são armazenados (invertido), em recipientes de plástico vedados à temperatura ambiente.

4) A manutenção C. elegans Cepas

1. Para manter bem alimentado C. estoques elegans, use um verme escolher para passar três L4s ou adultos grávidas para um novo, sem sementes NGM placa a cada 3-4 dias.
2. Placas de Loja (invertido), de preferência dentro de uma incubadora a 15 – 22 º C. Culturas em ensaios descritos foram armazenadas a 20 ° C. C. elegans desenvolvimento é dependente da temperatura. Como maintenance a temperatura aumenta, o tempo entre os estágios de desenvolvimento diminui.

5) Preparação de Tryptic Soy Agar (TSA), E. faecalis Meios de Cultura

1. Para fazer 50 placas, meça 500 ml de água destilada estéril para um frasco e leve para ferver, agitando, numa placa de aquecimento.
2. Adicionar 20 g de pó de ágar TSA ao balão e permita que a solução para dissolver.
3. Esterilizar a solução por autoclavagem, em condições normalizadas (121 psi, 120 ° C, 20 minutos).
4. Deixar a solução arrefecer até 45 ° C num banho de água.
5. Usando pipetas esterilizadas, adicione 10 ml de solução de agar para cada 60 milímetros de poliestireno placa de Petri. Permitir que os meios de comunicação para solidificar à temperatura ambiente durante a noite.

6) Preparação de Tryptic Soy Broth (TSB), E. faecalis Meios de Cultura

1. Para fazer com que os tubos 250 de cultura, medida a 500 ml de água destilada estéril para um frasco e quente numa placa de aquecimento com agitação. </li>
2. Adicionar 15 g de pó de ágar TSB para o frasco e para permitir que o pó se dissolver.
3. Esterilizar a solução por autoclavagem, em condições normalizadas (121 psi, 120 ° C, 20 minutos).
4. Deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente, em seguida, pipeta de 2 ml, em tubos de ensaio de 5 ml esterilizadas.

7) Preparação de Heart Infusion (BHI) Mídia Cérebro, com estreptomicina, para E. faecalis Cultura

1. Medir 500 ml de água destilada estéril para um frasco e leve para ferver, agitando, numa placa de aquecimento.
2. Adicionar 26 g de meio BHI ao balão e permitir que a solução para dissolver.
3. Esterilizar a solução por autoclavagem, em condições normalizadas (121 psi, 120 ° C, 20 minutos).
4. Deixa-se arrefecer a 45 ° C num banho de água.
5. Utilizando uma técnica estéril, adicionar 0,5 mL de uma solução de estoque de 10 mg de estreptomicina / ml e agite para misturar.
6. Adicionar 10 ml da solução a cada 60 milímetros de Petri de poliestireno.
<li> Permitir mídia para solidificar à temperatura ambiente durante a noite. Placas de Loja (invertida) a 4 ° C até algumas horas antes do uso.

8) Mantendo E. faecalis Cepas

1. Para manter E. estoques faecalis, use uma agulha esterilizada para raia colônias individuais em ágar placas de soja trípticos separados (TSA).
2. Crescer as culturas a 37 ° C durante a noite. Placas de Loja (invertida) em um saco ou caixa selada à temperatura ambiente durante várias semanas.

9) Preparar E. Placas faecalis para EIW Assay

1. Inocular uma cultura ml 2 TSB com uma colônia de E. faecalis e incubar durante a noite a 37 ° C.
2. Pipetar 20 ul de E. faecalis cultura para o centro de uma placa BHI-estreptomicina preparada, e incubar durante a noite a 37 ° C.

10) Preparar E. Placas coli para EIW Assay (placas de controlo)

1. Inocular um ml B-bro 100º cultura com uma colônia de E. coli OP50 e incubar durante a noite a 37 ° C
2. Pipetar 20 ul da cultura OP50 para o centro de uma placa NGM unseeded e permitir que as placas semeadas a secar à temperatura ambiente durante a noite.

11) Ovo em Ensaio Worm

1. Escolha 15-20 encenou-L4 C. elegans (Figura 1) para o centro de uma camada de bactérias numa preparada BHI-Strep-E. placa faecalis. Tenha cuidado para não transferir um monte de OP50 a placa BHI. Escolha o mesmo número de L4s a um controle de placa NGM-OP50.
2. Incubar as placas durante 40 horas a 20 ° C.
3. Preparar a solução de água sanitária a 20%. Misture a água sanitária comercial (hipoclorito de sódio a 6,0%) com o volume adequado de água destilada.
4. Adicione 10 gotas mL de solução de água sanitária para dez locais distintos em uma tampa de plástico (de um worm ou placa bacteriana).
5. Usando uma picareta verme, transferir um verme em cada gota de água sanitária. Agite suavemente a ponta dopegar na gota de água sanitária para certificar-se o worm tem lavado o fim da escolha (confirmar vendo a gota sob um microscópio de dissecação).
6. Permitir que a cutícula para dissolver durante cerca de 10 min ou até que os vermes se abriu, expelindo os ovos (Figura 2). Tenha cuidado para não transferir os ovos a partir da placa.
7. Usando um microscópio de dissecação, a contagem dos ovos em cada gota de água sanitária.

Representative Results

Discussion

Os passos mais importantes na realização com êxito neste ensaio são os seguintes: 1) usando stocks bem alimentados de C. elegans, 2) cultura de tipos individuais de bactérias na placa de ensaio, 3) identificação precisão encenado L4 vermes para a exposição a E. faecalis, 4), mantendo o tempo de exposição a E. faecalis consistentes em todos os ensaios e 5) branqueamento tempo não deve exceder 10 minutos para impedir a desintegração do ovo.

Para este ensaio, é importante escolher saudáveis, bem alimentados vermes. Inanição materna pode afectar o crescimento de fecundidade e progenitura ^19,20, portanto, é importante que os vermes foram bem alimentados durante várias gerações antes de executar este ensaio. Um estoque bem alimentado de vermes é de fácil manutenção, basta transferir alguns vermes adultos para uma nova placa NGM semeado a cada 2-3 dias. Dois dias antes do ensaio, os vermes adultos devem ser colocados em uma de OP50 relva fresca, a fim de ter suficiente L4 progenitura disponíveis para o ensaio.

<classe p = "jove_content"> É também importante que as chapas de ensaio EIW promover o crescimento de um único tipo de bactérias. E. faecalis estirpes foram cultivadas em placas de BHI. Estreptomicina foi adicionado às placas para seleccionar contra E. coli OP50, que é transferido com as L4 vermes como eles são transferidos de placas NGM manutenção para as placas de ensaio. OP50 também cresce em placas de BHI. Se não for selecionado contra, C. elegans que se alimentam de dois tipos de bactérias (E. coli e E. faecalis), enquanto que nas placas de BHI. As estirpes de E. faecalis usados ​​neste ensaio são resistentes à estreptomicina. Se foram utilizados diferentes tipos de bactérias para este ensaio, um antibiótico diferente, e talvez em diferentes meios de cultura, devem ser utilizados para seleccionar as bactérias de escolha e contra E. coli OP50.

Seleccionar vermes precisão encenado para este ensaio é crucial, por diversas razões. Em primeiro lugar, é importante contar com a retenção de ovo durante t ele tempo de produção de ovos / postura na C. auto-fertilização elegans. A produção de ovos ocorre apenas durante os primeiros cinco dias de C. elegans idade adulta (com um pico de cerca de 40 horas após a L4) e declina rapidamente depois ^4,21. Os vermes adultos vivem em média de duas a três semanas, tantos vermes adultos vivem por pelo menos uma semana, enquanto não produzir ovos fertilizados. Portanto, é importante ter a certeza que o ensaio EIW não é executada em vermes adultos unstaged de idade desconhecida.

A segunda razão, é importante o uso de animais encenado no ensaio EIW é de modo a que o tempo de desenvolvimento no qual os vermes terem sido expostos à bactéria, toxina ou fármaco é rigorosamente controlada. Culturas de C. elegans são normalmente sincronizadas para o ovo, L1 ou L4 fases. A fase L4 foi utilizado para este ensaio por causa da preocupação de que uma exposição mais longa de E. faecalis resultaria em letalidade antes de vermes adultos tornou-se grávidas.

tenda "> A duração do tempo de vermes são deixados na solução de branqueamento é também importante controlar. Worms normalmente deve dissolver-se em menos de dez minutos, embora este tempo varia de verme de verme. ovos fertilizados são eventualmente dissolvido por água sanitária, mas o processo de é mais lento do que para a cutícula, devido à presença de uma casca de ovo. casca do ovo começará a ser dissolvida pela água sanitária se deixado em solução durante mais de 10-15 minutos.

Retenção de ovos reflete o equilíbrio entre a produção de ovos e postura de ovos. O ensaio EIW sozinho não distingue se o número de ovos retidos no útero é devido a alterações na produção de ovos ou de postura de ovos. Isto é especialmente uma preocupação se vermes tratados com uma estirpe bacteriana ou toxina reter menos ovos do que aqueles no grupo de controle. Nestes casos, especialmente, um ensaio tamanho da ninhada follow-up deve ser feito. Ensaios tamanho da ninhada quantificar o número de ovos colocados ao longo da vida reprodutiva ⁴ do worm </sup>. Se o tamanho da ninhada de vermes nos grupos experimental e controle são as mesmas, então as diferenças na retenção de ovo pode ser atribuída a diferenças no comportamento de postura de ovos. Como é improvável que levemente estirpes patogénicas bacterianas como E. faecalis iria actuar para aumentar a produção de ovos, é razoável supor que um aumento da retenção de ovos após a exposição a E. faecalis (como visto na Figura 3) é um resultado da diminuição do comportamento de postura de ovos.

O ensaio também não EIW determinar o mecanismo através do qual as bactérias podem alterar a retenção de ovo. É possível que a C. elegans pode reter os ovos, pois as bactérias patogênicas afeta alimentação colonizando e bloqueando a abertura da boca ou porque é uma fonte de alimento pobre. Também é possível que as bactérias podem colonizar e bloquear a abertura da vulva, ou afectar a função das células do sistema oviposição. Uma análise adicional é necessário para determinar o mecanismo através do which retenção ovo é alterada.

Este ensaio EIW pode ser facilmente modificado para determinar os efeitos de diversos tipos de compostos na retenção de ovos. Além disso, este ensaio é suficientemente simples que pudesse ser incorporada uma tela para identificar genes, quer no hospedeiro (C. elegans) ou o agente patogénico (E. faecalis), exigido para o efeito do agente patogénico. O ensaio EIW também pode ser usado para o rastreio de genes necessários para a regulação da postura em si. C. elegans comportamento de postura de ovos é modulado por neurotransmissores como a serotonina e acetilcolina ^5-9, e requer a atividade coordenada de vários neurônios e grupos musculares ^12. EIW ensaios têm sido e continuam a ser utilizados para identificar genes importantes para a sinalização de neurotransmissores e / ou a actividade muscular. EIW ensaios fornecem um quantitativo, ao invés de qualitativa, a análise de uma importante C. elegans comportamento.

Materials

Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
<em>C. elegans</em>, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for <em>C. elegans</em>	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for <em>E. faecalis</em>	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
<em>E. coli </em>(OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
<em>E. faecalis</em> strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
<p>all strains grew at 44.5 &ordm;C and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified&nbsp;<span style="line-height: 1.6em;">dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">(arabinose, mannitol, methyl-&alpha;-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">presumptive identification of all <em>E</em>. <em>faecalis</em> strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).</span></p>
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000