A sorotipagem capsular de Streptococcus pneumoniae Usando o Reaction Quellung

Resumo

A reação Quellung é a técnica padrão ouro para sorotipagem Streptococcus pneumoniae. Esta técnica utiliza um microscópio e anti-soros específicos pneumocócica e é comumente usado em referência e laboratórios de pesquisa em todo o mundo.

Resumo

Há mais de 90 diferentes sorotipos capsulares de Streptococcus pneumoniae (pneumococo). Além de ser uma ferramenta para a compreensão da epidemiologia pneumocócica, sorotipagem capsular pode fornecer informações úteis para os estudos de eficácia da vacina e de impacto. A reação Quellung é o método padrão-ouro para pneumocócica sorotipagem capsular. O método envolve o teste de uma suspensão de células com anti-soros de pneumococos em pool e específico dirigido contra o polissacarídeo capsular. As reacções antigénio-anticorpo são observadas ao microscópio. O protocolo tem três passos principais: 1) preparação de uma suspensão de células bacterianas, 2) mistura de células e anti-soros sobre uma lâmina de vidro, e 3) a leitura da reacção de Quellung, usando um microscópio. A reacção de Quellung é razoavelmente simples de realizar e pode ser aplicada sempre que um microscópio e os anti-soros adequados estão disponíveis.

Introdução

Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é responsável pela morte de cerca de 800 mil crianças menores de cinco anos de idade, anualmente, com o fardo da doença caindo predominantemente em países com poucos recursos ^1. Doenças pneumocócicas variar em gravidade de infecções localizadas, como a otite média aguda a infecções fatais graves, como septicemia, meningite e pneumonia ^2. Mais de 90 serótipos capsulares de pneumococos têm sido descritas ^{3, 4.} Vacinas pneumocócicas actuais proporcionam protecção contra os serótipos que são responsáveis ​​pela maioria das doenças invasivas ^{5, 6.} No entanto, o uso difundido de vacinas tem sido associada com a substituição de serotipos incluídos na vacina por serotipos não vacinais, tanto na nasofaringe e doença invasiva ^{7, 8.} Isso ressalta a importância de sorotipagem para epidemiológicavigilância e impacto da vacina a longo prazo estuda ^9.

O método padrão-ouro para a digitação pneumocócica é o teste de reação capsular, conhecida como a reação Quellung, descrita pela primeira vez por Neufeld, em 1902 (ver austríaco ^10). Foi encontrado um elevado grau de concordância entre laboratórios, e entre a reacção de Quellung e outros métodos de sorotipagem ^11-13. Existem várias variações da reacção de Quellung, ^{10, 14-16.} O método aqui descrito não requer a utilização de um contador de manchas ou a lente de imersão em óleo, em vez disso, uma gota de amostra preparada é misturada com o soro de tipagem e examinadas imediatamente sob uma ampliação de 400X.

A reacção de Quellung, é geralmente realizada usando anti-soros disponíveis comercialmente. O método descrito aqui utiliza anti-soros menos em comparação com alguns dos outros métodos ^{16, 17,} tornando-se mais rentável. Uma vez que um isoladorComeram é identificado como um pneumococo, é sequencialmente testados com anti-soros piscinas até uma reacção positiva é observada. Cada soro piscina contém diferentes misturas de anti-soros produzidos contra 91 sorotipos de pneumococo ^18. Uma vez que a piscina está estabelecido, o tipo de indivíduo e grupo anti-soros que são incluídos na associação reactiva são testados individualmente em sequência. Tipo soros geralmente reagem com um único sorotipo (por exemplo, tipo 1 soro reage com o sorotipo 1), enquanto que os anti-soros grupo reagir com todos os sorotipos de um grupo específico (por exemplo, Grupo 22 anti-soro reage com sorotipos 22F e 22A). Alguns sorotipos dentro dos grupos são mais diferenciadas com fator anti-soros (por exemplo sorotipo 22F reage com fator 22b, 22c, mas não). Neste caso o teste é continuado com todos os anti-soros factor relevante é determinada até serótipo ^{19, 20.} A reacção de Quellung, é simples e rápida e ¹⁴ pode ser realizada em qualquer laboratory que está equipado com um microscópio de boa qualidade e um conjunto adequado de anti-soros.

Protocolo

1. Preparação da suspensão de células para digitação

1. Usando um circuito descartável 1 ml estéril, dê uma pequena varredura de fresco durante a noite pura cultura de pneumococos cultivadas em ágar sangue de cavalo não seletivo sólida e inocular 100 mL Heart Infusion (HI) caldo. A suspensão deve aparecer para ser apenas visivelmente turva. Agite suavemente o tubo para emulsionar.
   Nota: Outras mídias, como caldo Brain Heart Infusion também podem ser adequados. A adição de soro (por exemplo, uma concentração final de 10% (v / v) de soro de cavalo) e incubação a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora antes da utilização pode ser usado para aumentar a reacção.

2. Verificando densidade de suspensão celular

A suspensão de células, preparado no passo 1.1, também irá ser utilizada como controlo negativo, e deve ser verificada a densidade de células antes da adição de soros de digitação.

1. Utilizando um ciclo de 1 ml, transferem uma gota de inoculo, preparado no passo 1.1 para um coposlides s microscópio.
2. Utilizando um par de pinças, colocar uma pequena lamela circular sobre a suspensão.
3. Usando o ajuste de contraste de fase, a preparação observar microscopicamente com uma ampliação de 400x, para verificar a densidade da suspensão (Figura 1A).
   1. Se o inoculo é demasiado pesada (Figura 2A), adicionar mais caldo para a suspensão de células feitas no passo 1.1 para a diluir. Delicadamente misture novamente.
   2. Se o inóculo é muito leve, por exemplo, existem <50 células visíveis no campo microscópico (Figura 2B), adicionar mais bactérias para a preparação da suspensão de células feitas no passo 1.1 e misturar suavemente.
      Nota: Com a experiência, a densidade da suspensão de células pode ser julgada pelo tremendo e segurando-se para a luz, onde ele deve aparecer para ser apenas visivelmente turva.
4. Repita os passos 2,1-2,3 até que um número adequado de células estão disponíveis no campo do microscópio.
   Nota: lâminas de vidro e coverslips apresentar um risco de farelos. Após o uso, lâminas e lamínulas estão contaminados com material infeccioso e deve ser descartado em um recipiente biohazard farelos.

3. Datilografia

1. Transferir ~ 1 ul do inoculo preparado (por exemplo, utilizando um ciclo de pi 1) sobre a lâmina de vidro de microscópio. Descarte o loop para o recipiente biohazard farelos.
2. Adicionar um volume igual (1 ml ansa cheia) de temperatura ambiente anti-soro para o slide e misturar os dois cai bem com o loop.
3. Usando um par de fórceps, coloque uma pequena lamela circular sobre a suspensão, tomando cuidado para não tocar a queda. Coloque a lamela sobre a suspensão imediatamente após a adição de anti-soros para impedir o líquido no diapositivo de secar.
4. Usando um microscópio, observe a suspensão nos termos de contraste de fase com aumento de 400X. Uma reacção negativa Quellung é observada quando pouco ou nenhum "inchaço" das células de pneumococos pode ser visto em 40Ampliação 0X, semelhante ao que é observado na suspensão de células de pneumococo, com anti-soros não adicionado (controlo negativo). Observou-se uma reacção positiva Quellung quando as células parecem alargada ou "inchado" e mais visível quando comparado com as células do controlo negativo.
   Nota: As reacções ambíguos devem ser investigada, por exemplo, examinando a reacção após 5-10 min de incubação à temperatura ambiente, ou por repetição da reacção com mais soro.
5. Conduzir sorotipagem pneumocócica com testes sucessivos de piscinas anti-soros individuais até uma reação positiva é observada. Alternativamente, piscinas pode ser aplicado em 'rodadas', dependendo da incidência local dos sorotipos.
   Nota: Testes em 'rodadas' garante que as piscinas que contêm anticorpos para os sorotipos mais comuns são testados primeiro, minimizando o esforço e custo. Teste simultâneo de várias piscinas também fornece controles negativos adicionais, o que pode ser útil em interpretation. Se todas as piscinas em um 'round' em particular são negativos, testar o isolado com rodadas subseqüentes de piscinas.
6. Testar o isolado usando o apropriado tipo ou grupo de soro contida na piscina reactivo. Se for o caso, use fator anti-soros para diferenciar ainda mais o sorotipo.
   Nota: Chaves para o anti-soros pneumocócica fornecidos pelo fabricante são usados ​​na seleção de piscina adequada, tipo, grupo ou fator anti-soros e interpretação dos resultados (incluindo quaisquer reações cruzadas).
7. Se os resultados negativos são obtidos com todas as piscinas, testar o isolado com reagente Omniserum (contém anticorpos contra 91 sorotipos ^21). Se uma reacção positiva Quellung ainda não se observa ao testar uma pneumocócica isolar com o reagente omniserum, isto pode ser porque o isolado está expressando pouca ou nenhuma cápsula, ou que os anticorpos contra o serotipo não estão representados na omniserum. Esta última categoria pode incluir novos sorotipos.

Resultados

Uma reacção positiva ocorre quando Quellung anticorpo específico para o tipo de liga-se a cápsula do pneumococo, levando a uma mudança no seu índice de refracção ^10. Quando visto sob um microscópio, as bactérias parecem 'inchado' e mais visível ^14. Figura 1A mostra células pneumocócicas em caldo de HI. Quando anti-soro específico do tipo é adicionada à suspensão bacteriana, os pneumococos aparecer "inchado", de refracção e mais arredondada (Figura 1B).

Muitas células bacterianas adicionados ao caldo pode resultar em agregação de células ou de uma reacção de falso negativo. Figura 2 mostra inóculos de células em caldo de IC pneumococos que são "demasiado pesado" (Figura 2A) ou "muito leve" (Figura 2B).

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Figura 1. Quellung reação negativa e positiva. Preparações de sorotipo 9V pneumocócica isolar sem soro (1A) e com o grupo de 9 anti-soro (1B), eram vistos sob aumento de 400X. Este último mostra o 'inchaço' e arredondamento das células bacterianas, tipicamente visto em uma reação positiva Quellung.

Figura 2. Inóculos muito pesado e muito clara. Preparações de suspensões de células de pneumococos que são demasiado pesadas (2A) ou muito clara (2B), quando vistos sob aumento de 400X.

Discussão

Um passo essencial na presente técnica é garantir uma cultura pura é usado para preparar a suspensão, juntamente com a adição de um número adequado de células bacterianas para o caldo. Deve notar-se que o crescimento da colónia e morfologia em placas de agar varia entre os diferentes isolados de pneumococos. Alguns produzem colônias seca e áspera, o que pode ser difícil de apanhar com um laço e não emulsionar bem no caldo. Por este motivo, uma varredura maior de bactérias pode ser requerida quando se prepara a suspensão de células. Em qualquer dos casos, é imperativo que as células individuais e não agregados, são evidentes no controlo negativo assim o seu tamanho relativo pode ser comparado com as células com anti-soro adicionado. Para além disso, muitas células bacterianas podem resultar numa reacção de falso negativo, onde um excesso de antigénio capsular podem inibir a reacção de Quellung ^10. Por esta razão, é importante criar uma suspensão de bactérias com uma densidade de células adequada (Figura 1). A suspensão pode ser preservado por vários meses com a adição de algumas gotas de formol concentrado. Isso permite que os ensaios de lote mais fácil e também esteriliza o caldo reduzir o risco de infecções adquiridas em laboratório, embora isso deve ser pesado contra o risco de segurança de lidar com formol, que é tóxico, corrosivo, cancerígenas, sensibilizando e inflamável. Além disso, observou-se que alguns isolados mostram reacções fracas na presença de formalina (dados não mostrados).

Reacções Quellung são examinados usando um microscópio. A utilização de contraste de fase aumenta a visibilidade da cápsula. Em alguns laboratórios, a reação é visto usando de imersão em óleo a 1.000 ampliação X ^{14, 16.} Além disso, alguns laboratórios utilizam uma mancha contador (azul de metileno), para aumentar ainda mais a visibilidade de uma reacção positiva ^{10, 16, 22.} O método aqui apresentado é visto sem óleo-immersion e sob aumento de 400X ^{15, 17.} Este método é rápido, simples e relativamente fácil de ler ^23.

É importante manter bons procedimentos de controle interno de qualidade para garantir que os procedimentos de anti-soros, testes estão em ordem. A participação em um programa de garantia de qualidade externa é muitas vezes benéfico.

Uma das principais limitações da reacção de Quellung para serotipagem de pneumococos é o elevado custo dos anti-soros é necessária. No entanto, este é minimizado no protocolo de cima, devido à pequena quantidade de anti-soro utilizado para cada reacção. Vários outros métodos têm sido descritos para serotipagem de pneumococos ^{23, 24.} No entanto, Quellung continua sendo o padrão ouro eo desenvolvimento de novos métodos requer padronização contra a reação Quellung ^23. Utilizando anti-soro apropriado, a reacção de Quellung, também pode ser utilizado para identificar e tipo de outros tampõesule bactérias produtoras ^25. A reação Quellung é fundamental para a caracterização de sorotipos de pneumococo atuais e emergentes, bem como a prestação de informações sobre a eficácia da vacina e do impacto a longo prazo da vacinação no transporte e na doença.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pneumococcus (Neufeld) anti-soro	SSI Diagnostica		http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Leve todos os anti-soros à temperatura ambiente antes de usar
Pneumococcus (Omni) anti-soro	SSI Diagnostica	2438	Leve todos os anti-soros à temperatura ambiente antes de usar
Microscópio óptico	Leica Microsystems	Leica DML
Calibrado Descartável Inoculando Loops 1 µ l	Copan	CD175S01
Placas de ágar sangue de cavalo (HBA)	Thermo Fisher Scientific	PP2001	http://www.thermofisher.com.au/ Leve à temperatura ambiente antes de usar
Caldo de infusão cardíaca (HI)	Unidade de preparação de mídia (MPU), Universidade de Melbourne	40HIN	Leve à temperatura ambiente antes de usar
Lâminas de microscópio de vidro 76 mm x 26 mm	Lomb Scientific	7101	Perigo de perfurocortantes: Descarte em um recipiente de perfurocortantes de risco biológico
Lamínulas de vidro circulares	NeuVitro	GG-5
*Excluindo os anti-soros, todos os outros materiais podem ser adquiridos de fornecedores alternativos
*Placas preparadas a partir de sangue de ovelha desfiado são adequadas, mas placas de sangue preparadas a partir de sangue citrado ou sangue humano não são