Caracterização de Sistemas Complexos Usando o Projeto de Experimentos Abordagem: Transient Protein Expression em tabaco como um Estudo de Caso

Summary

Descreve-se um desenho de experiências abordagem que pode ser utilizada para determinar e modelar a influência dos elementos de regulação de transgenes, de crescimento e de desenvolvimento de parâmetros de planta, e as condições de incubação sobre a expressão transiente de anticorpos monoclonais e proteínas repórter em plantas.

Abstract

As plantas fornecem benefícios múltiplos para a produção de biofármacos incluindo os custos baixos, escalabilidade e segurança. A expressão transiente oferece a vantagem adicional de curto desenvolvimento e tempos de produção, mas os níveis de expressão podem variar significativamente entre os lotes, dando assim origem a preocupações regulatórias no contexto das boas práticas de fabrico. Foi utilizado um planejamento de experimentos (DoE) abordagem para determinar o impacto dos principais fatores, como elementos reguladores na construção de expressão, o crescimento das plantas e os parâmetros de desenvolvimento e as condições de incubação durante a expressão, sobre a variabilidade de expressão entre os lotes. Foram testadas as plantas que expressam um anticorpo modelo anti-HIV anticorpo monoclonal (2G12) e uma proteína de marcador fluorescente (DsRed). Discutimos a justificativa para a seleção de certas propriedades do modelo e identificar suas possíveis limitações. A abordagem geral pode ser facilmente transferido para outros problemas, porque os princípios do modelo de umre amplamente aplicável: seleção de parâmetros baseada no conhecimento, a redução da complexidade, dividindo o problema inicial em módulos menores, de configuração guiada por software de combinações experimentais óptimas e aumento do projeto passo a passo. Portanto, a metodologia é útil não só para caracterizar a expressão da proteína em plantas, mas também para a investigação de outros sistemas complexos que faltam uma descrição mecanicista. As equações de previsão que descrevem a interligação entre os parâmetros podem ser utilizados para estabelecer modelos mecanísticos para outros sistemas complexos.

Introduction

A produção de proteínas biofarmacêutica em plantas é vantajoso porque as plantas são baratos a crescer, a plataforma pode ser aumentado apenas por crescimento mais plantas, e os agentes patogénicos humanos são incapazes de se replicar ^{de 1,2.} Estratégias de expressão transitória por exemplo com base na infiltração das folhas com Agrobacterium tumefaciens proporciona benefícios adicionais, porque o tempo entre o ponto de libertação de ADN e a entrega de um produto purificado é reduzida de anos a menos do que 2 meses ^3. A expressão transiente é também utilizado para a análise funcional, por exemplo, para testar os genes para a su....

Protocol

1. Planejando uma Estratégia de DoE

1. Identificar os fatores e as respostas relevantes para a inclusão no projeto.
   1. Defina uma ou várias respostas para a medição. Aqui, foram usadas 2G12 e DsRed níveis de expressão (ug / ml), incluindo a diferença mínima detectável considerados relevantes (10 e 20 ug / ml, respectivamente) e um valor aproximado para o desvio padrão estimado do sistema (4 e 8 ug / ml, respectivamente), com base em experiências anteriores.
   2. Use a literatura disponível, os dados de experiências anteriores ou projetos de triagem especializados (por exemplo, um planejamento fatorial, ver a introdução) para selecionar fat....

Results

Um modelo descritivo para acumulação durante DsRed expressão transitória utilizando diferentes promotores e 5'UTRs

DsRed fluorescência nos extractos de folhas foi utilizado para indicar o nível de expressão da proteína recombinante e, assim, foi utilizada como a resposta na estratégia DOE. A diferença mínima detectável foram consideradas relevantes foi de 20 ug / ml e o desvio padrão estimado do sistema foi de 8 ug / ml com base em experiências iniciais. Fatores incluídos no.......

Discussion

Cada experimento requer um planejamento cuidadoso, porque os recursos são muitas vezes escasso e caro. Isto é particularmente verdadeiro para as estratégias DoE porque erros durante a fase de planejamento (por exemplo, a seleção de um modelo de base que não cobre todas as interações fator significativo) pode diminuir substancialmente a capacidade de previsão dos modelos resultantes e, assim, desvalorizar todo o experimento. No entanto, esses erros podem ser facilmente evitado, seguindo procedimentos básicos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Especialista em Design (R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.DoE	software
Triptona	Carl Roth GmbH	8952.2	Componente de mídia
Extrato de levedura	Carl Roth GmbH	2363.2	Componente de mídia
Cloreto de sódio	Carl Roth GmbH	P029.2	Componente de mídia
Ampicilina	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiótico
Ágar-ágar	Carl Roth GmbH	5210.2	Componente de mídia
Escherichia coli K12 DH5a	Life Technologies	18263-012
Microrganismo pPAM	GenBank	AY027531	Vetor de clonagem/expressão;
NucleoSpin Plasmídeo	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Kit de isolamento de DNA de plasmídeo
NucleoSpin Gel e PCR Clean-up	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Kit de purificação de DNA de plasmídeo
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.Espectrofotômetro
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restriçãoendonuclease
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R3101L	Restriçãoendonuclease
AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L	Restriçãoendonuclease
NEB 4	New England Biolabs Inc.	B7004S	Restriçãotampão endonuclease
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Componente de mídia
Tetraborato dissódico	Carl Roth GmbH	4403.3	Componente de mídia
EDTA	Carl Roth GmbH	8040.2	Componente de mídia
Agarose	Carl Roth GmbH	6352.4	Componente de mídia
Azul de bromofenol	Carl Roth GmbH	A512.1	Indicador de cor
Xileno cianol	Carl Roth GmbH	A513.1	Indicador de cor
Glicerol	Carl Roth GmbH	7530.2	Componente de mídia
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Câmara de eletroforese em gel
Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101:pMP90RK	DSMZ	12365	Microrganismo
Electroporator 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporator
Extrato de carne Carl	Roth GmbH	X975.2	Componente de mídia
Peptona	Carl Roth GmbH	2365.2	Componente de mídia
Sacarose	Carl Roth GmbH	4621.2	Componente de mídia
Sulfato de magnésio	Carl Roth GmbH	0261.3	Componente
Carpenicilina	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiótico
Canamicina	Carl Roth GmbH	T832.3	Antibiótico
Rifampicina	Carl Roth GmbH	4163.2	Antibiótico
FWD primer	Eurofins MWG Operon	n.a.CCT	CAG GAA GAG CAA TAC
REV primer	Eurofins MWG Operon	n.a.CCA	AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Termociclador	Applied Biosystems	4359659	Termociclador
RNAfold	webserver Universidade de Viena	n.a.Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizante
Grodan Cubos de lã de rocha 10 x10 cm	Grodan	n.a.Bloco	de lã de rocha
Estufa	n.a.n.a.Para		cultivo de plantas
Phytotron	Ilka Zell	n.a.Para	cultivo de plantas
Omnifix-F Solo	B. Braun	6064204	Seringa
Murashige e sais de Skoog	Duchefa	M 0222.0010	Componente de mídia
Glicose	Carl Roth GmbH	6780.2	Componente de mídia
Acetosiringona	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Análogo
de fitohormon  Biofotômetro mais	Eppendorf	6132 000.008	Fotômetro
Osram branco frio 36 W	Osram	4930440	Fonte de luz
Fosfato dissódico	Carl Roth GmbH	4984.3	Componente de mídia
Centrífuga 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrífuga
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Leitor de placas de fluorescência
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.SPR
dispositivo Proteína A	Life Technologies	10-1006	Proteína de ligação ao anticorpo
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Componente de mídia
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Componente de mídia
2G12 anticorpo	Anticorpo de referência Polymun	AB002