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Artigo de método

Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications

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DOI:

10.3791/51218

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27 de janeiro de 2014

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1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

Neste artigo

Resumo

Ativação persistente de inibição G receptores acoplados à proteína resulta em sensibilização da adenilil ciclase sinalização. Para identificar as vias moleculares essenciais, abordagens nonbiased são necessárias, no entanto, esta estratégia requer o desenvolvimento de um ensaio escalável sensibilização AMPc baseado em células. Relata-se um ensaio de sensibilização para a pequena molécula e triagem siRNA.

Resumo

Sensibilização de adenilil-ciclase (AC) de sinalização tem sido implicada numa variedade de distúrbios neuropsiquiátricos e neurológicas, incluindo o abuso de substâncias e na doença de Parkinson. Activação aguda de Gαi / O-ligada receptores inibe a actividade de AC, enquanto que a activação persistente de estes receptores resulta na sensibilização heteróloga de CA e um aumento dos níveis de AMPc intracelular. Estudos anteriores demonstraram que esta melhoria da capacidade de resposta de CA é observada tanto in vitro e in vivo a seguir a activação crónica de vários tipos de receptores Gαi / ligada a O, incluindo D 2 da dopamina e μ receptores opióides. Apesar de sensibilização heteróloga do AC foi relatada pela primeira vez há quatro décadas, o mecanismo (s) que estão na base deste fenômeno são ainda desconhecidas. A falta de dados mecanicistas presumivelmente reflete a complexidade envolvida com esta resposta adaptativa, o que sugere que as abordagens nonbiased poderia ajudar na identificaçãoção das vias moleculares envolvidas na sensibilização heteróloga do AC. Estudos anteriores têm implicado quinase e sinalização Gbγ como sobreposição de componentes que regulam a sensibilização heteróloga do AC. Para identificar alvos sobrepostos únicos e adicionais associados com a sensibilização da AC, o desenvolvimento ea validação de um ensaio de sensibilização cAMP escalável é necessário para uma maior taxa de transferência. As abordagens anteriores para estudar sensibilização são geralmente complicado que implica a manutenção de cultura de células contínuo, bem como uma complexa metodologia para medição da acumulação de AMPc que envolve vários passos de lavagem. Assim, o desenvolvimento de um ensaio de base celular robusto, que pode ser utilizado para rastreio de alto rendimento (HTS) em um formato de 384 poços iria facilitar estudos futuros. Usando dois modelos celulares D 2 receptores de dopamina (ie. CHO-D 2D e HEK-AC6 / D 2D), convertemos o nosso ensaio de sensibilização 48 poços (> 20 passos 4-5 dias) para um período de cinco step, ensaio dia único em formato de 384 poços. Este novo formato é passível de triagem pequena molécula, e que demonstram que este desenho do ensaio também pode ser facilmente utilizado para a transfecção reversa de siRNA em antecipação de rastreio da biblioteca de siRNA alvo.

Introdução

Um adenililciclase adaptativo (AC) de sinalização de resposta conhecida como a sensibilização de super-heteróloga ou foi descoberto pela primeira vez no laboratório do Prêmio Nobel, Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg proposto que o aumento da capacidade de resposta AC observado após a ativação do receptor opióide δ crônica era um mecanismo envolvido na tolerância e dependência de opiáceos 1. Além disso a activação do receptor opióide δ crónica, esta resposta neuroadaptativo de sinalização AC também ocorre a seguir a activação persistente de vários outros Gαi / acoplada-o-receptores 2. Notavelmente, muitos destes receptores estão associados com a dor, distúrbios neuropsiquiátricos e neurológicas, e incluem opióide μ / κ, D 2/4 da dopamina, 5HT 1A, e M 2/4 receptores muscarínicos 2. Além de descobertas do Dr. Nirenberg, um grande corpo de evidências que liguem sensibilização de sinalização AC para a ativação do receptor opióide crônica tanto in vitro e in vivo 3-7. Sensibilização de CA também tem sido associado com uma variedade de doenças que envolvem receptores de dopamina D-2, como incluindo esquizofrenia e da doença de Parkinson (para revisão ver referência 2). Apesar da importância potencial de sensibilização, o mecanismo preciso (s) associado com a ativação persistente Gαi / acoplada-o receptor que leva ao aumento da capacidade de resposta AC permanece em grande parte desconhecido.

Estes estudos fornecem a justificativa para examinar os mecanismos de sensibilização dos adenililciclase como um importante alvo neurobiológica. Da mesma forma, a relevância fisiológica da AC sinalização 8 e a importância que as isoformas individuais de corrente alternada conter nesta resposta adaptativa também deve ser reconhecido 2,9,10. No contexto de nossa pesquisa, as características gerais associadas com a sensibilização heteróloga das isoformas recombinantes de AC paralelo essas características descrita para estudar as isoformas endógenos de AC. Especificamente, pesquisas anteriores descobriram que a ativação de proteínas Gαi / o e subunidades posterior liberação / βγ rearranjo são requisitos importantes para a sensibilização do receptor induzida de todas as isoformas de AC. Além disso, diversos estudos sugerem que a sinalização de proteina-quinases e subunidades Gβγ esteja envolvido na sensibilização 2,11-13. ACs individuais também exibir padrões de sensibilização únicas e distintas 12. Por exemplo, a exposição persistente de receptores D 2 de agonistas está relacionado com a sensibilização de AC1 e AC8 em Ca 2 + / calmodulina 14,15 estimulação, ao passo que a AC3 estreitamente relacionada não é sensibilizado 2. AC2, AC4, e AC7 estão intimamente relacionados, no entanto, apenas a actividade da PKC-AC2 é estimulado de forma robusta sensibilizadas depois de exposição prolongada de receptores D 2 de agonistas 7,14,16,17. Além disso, AC5 e AC6 mostram um acentuado grau de hetersensibilização para ologous e Gás-acumulação de AMPc estimulada por forskolin após a ativação de receptores D 2 14,18-20, mas parecem diferir em sua exigência para Gβγ subunidade-AC interações 21. Embora a maioria dos estudos de sensibilização AC usaram linhagens de células modelo (por exemplo, células HEK293 expressando isoformas AC individuais), parece que estes resultados traduzem-se em modelos de células neuronais nativos 4,22. Mais recentemente, os efeitos de inibidores selectivos de pequenas molécula de isoformas AC identificados em células HEK293 que expressam as isoformas AC também podem ser convertidos para os estudos in vivo do comportamento 23.

A falta de um mecanismo molecular para a identificação de sensibilização heterólogo provavelmente reflecte a complexidade da resposta adaptativa, bem como as propriedades reguladoras únicas do indivíduo AC isoformas 12. Desvendando tal complexidade é ainda mais complicada pelo uso de metodologia pesado tchapéu limitou investigadores académicos de empregar abordagens imparcial. Por exemplo, os nossos estudos mecanísticos envolveu o uso de modelos celulares continuamente cultivadas utilizando 24 - e 48-formato de poço de cultura de tecidos de 15. As células em cultura foram normalmente cultivadas durante 48 horas e, em seguida, submetido a tratamento com drogas agonistas (2-18 horas), seguido por uma série de lavagens e incubações de células (Figura 1). AC-isoforma específica de cAMP de acumulação protocolos foram então empregues, seguido por medição da acumulação de cAMP utilizando um processo trabalhoso e demorado [3 H] metodologia 15,24 ligação cAMP. A duração do início ao fim, para cada ensaio, geralmente requerido um total de quatro a cinco dias de plaqueamento de células para análise de dados (Figura 1). A aplicação de novas tecnologias e automação tem levado a melhorias marcado para estudos de sensibilização no ambiente industrial e HTS centro. Por exemplo, um grupo de trabalho com o Centro Nacional de Chemical Genomics relatou um dia dois HTS processo de ensaio para identificar pequenas moléculas inibidoras da μ do receptor opióide sensibilização induzida no formato 1536-25 bem.

O presente artigo descreve os nossos esforços para desenvolver um ensaio HTS para estudos de sensibilização heteróloga utilizando tecnologias que estão disponíveis na maioria das instituições de pesquisa acadêmica. Esta estratégia foi conseguida por incorporação do uso de células criopreservadas de modelos celulares expressando heterologamente o receptor de dopamina D 2 em combinação com as isoformas de adenilil-ciclase recombinante endógenos ou individuais (CHO-D 2L ou células HEK-AC6 / D 2 L). Para melhorar o nosso rendimento, redesenhamos nosso ensaio de sensibilização 48 bem (cerca de> 20 passos mais 4-5 dias) para um de cinco etapas, ensaio dia único em formato de 384 poços que era essencialmente "misturar e ler". O novo formato utiliza um tempo homogêneo de fluorescência resolvida disponível comercialmente (HTRF) ensaio para medir cAMP accumulation em células intactas com um leitor de placa de multi modo. O ensaio é robusto e passíveis de triagem pequena molécula, e pode ser efectivamente aplicado a triagem de inibidores de sensibilização heteróloga. Além disso, podemos fornecer dados que permitem o uso deste ensaio com transfecção reversa de siRNA para triagem ampla biblioteca siRNA alvo ou genoma, com apenas uma pequena modificação para a abordagem geral.

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Protocolo

1. Expansão e criopreservação de células Ensaio Pronto

  1. Cultura de CHO-K1-DRD 2L células (CHO-D 2L) sobre uma cultura de células prato 15 centímetros 2 em meio F12 de Ham enriquecido com 1,0 uM de L-glutamina, 800 ug / mL de G418, 300 ug / higromicina ul, 100 U / ul penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina, e 10% de soro fetal bovino (FBS).
  2. Incubar as células a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO2 até as células são 90-95% confluentes. Lavar as células com 10 uL de Tampão Fosfato Salino (PBS), e colher as células por adição de 3 ul de tampão de dissociação de células durante 5 min a 37 ° C. Ressuspender as células utilizando 12 mL dos meios de cultura e contagem de células usando exclusão do azul de tripan.
  3. Centrifugar a suspensão de células a 500 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 mL de meio de congelação (10% de dimetil sulfóxido, 90% FBS). Dilui-se a suspensão de células para se conseguir a concentração desejada de células (por exemplo, 1-20 x 10 6 células / mL).
  4. Alíquota 1,0 mL da solução de célula para cada cryovial. Incubar as criotubos em um recipiente de congelação de células a -80 ° C durante a noite. Transferir os criotubos para um líquido N2 tanque para o armazenamento de longo prazo.

2. Cultivo de células Pronto Ensaio (e transfecção reversa opção)

  1. Rapidamente descongelar um criotubo gelado de células em um banho de água a 37 C º. Uma vez que as células são descongelados, transferir as células para um tubo cônico de 15 mL contendo 9 mL de Opti-MEM, e misturar invertendo o tubo 3-5x.
  2. Centrifugar as células a 500 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de Opti-MEM.
  3. Contar as células usando exclusão com azul de tripano para determinar a viabilidade das células e diluir as células viáveis, conforme necessário (por exemplo. De 3 x 10 5 células / mL de concentração) emOpti-MEM. Placa 10 uL / ​​poço de células em cultura de tecidos tratados placa de 384 poços com uma pipeta multicanal.
  4. Fazer diluições seriadas de AMPc em Opti-MEM para gerar uma curva padrão para estimar a produção de cAMP por as células (de acordo com a recomendações do fabricante - ver Secção 7). Adiciona-se 10 uL / poço dos padrões de cAMP à placa Nota:. Uma curva padrão único pode ser preparado sobre uma placa separada ou poços em branco sobre uma das placas de ensaio.
  5. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente, e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 1 hora.

3. SiRNA transfecção opção Inverter *

Esta secção é opcional e relevante para a Figura 3.

  1. Prepara-se uma solução de siRNA em DDH RNase 2 O (por exemplo, de 0,4 pmol / ul). Adicionam-se 5 ul a poços individuais de placas de 384 poços, e centrifugar a placa a 100 xg por 15 sic à temperatura ambiente.
  2. Diluir Lipofectamina 2000, em Opti-MEM por um fator de 0,006 (por exemplo, adicionar 6 mL de Lipofectamina 2000 a 1000 l de Opti-MEM), e misture por pipetagem cima e para baixo.
  3. Incubar a solução Lipofectamine 2000/Opti-MEM durante 5 min à temperatura ambiente. Adicionar 5 ml da solução de Lipofectamine 2000/Opti-MEM diluída para poços individuais de placas de 384 poços que já contém siRNA. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente.
  4. Incubar a placa durante 30 minutos à temperatura ambiente.
  5. Células prontas ensaio em placa, como descrito acima (Seção 2). Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente.
  6. Retornar placa de ensaio para incubadora humidificada a 37 ° (5% CO 2) C durante 48-96 horas, tal como determinado para o gene alvo derrubar (ver discussão).

4. Pequeno Screening Molecule

  1. Dilui-se o fármaco de interesse (por exemplo, inibidores. Moléculas pequenas) em Opti-MEM a 6x a concentração final desejada. Diluições em série pode ser concluída usando pipetas de mão ou uma estação de tratamento de líquido.
  2. Adicionar 2,5 mL / poço de composto de teste ou tampão contendo veículo (por exemplo, DMSO) para o lado das cavidades com uma pipeta multicanal.
  3. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente (incubação é opcional).

5. Persistente tratamento com o agonista

  1. Prepara-se uma de 600 nm (ou seja. 6 vezes a concentração final desejada de 100 nM), solução de quinpirole em Opti-MEM.
  2. Adicionar 2,5 mL / poço de solução quinpirole 600 nM para o lado das cavidades com uma pipeta multicanal.
  3. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente, e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 2 horas.

6. Estimulação de AMPc Acumulação

  1. Durante a incubação de 2 horas, preparar as stimulatiem solução em Opti-MEM. A solução de estimulação é composta por 40 uM de forscolina, 2 uM de 3-isobutil-1-methyxanthine (IBMX), e 4 uM espiperona (todas as concentrações no passo 6 são 4x a concentração final desejada).
  2. Adicionar 5 uL / ​​poço da solução de estimulação para o lado das cavidades com uma pipeta multicanal.
  3. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente, e incubar à temperatura ambiente durante 1 hora.

7. Têmpera e Estimativa de cAMP Acumulação

  1. Produção de AMPc pelas células é medida utilizando o kit de cAMP dinâmica 2, de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, reconstituir anti-cAMP-criptato e cAMP-d2 em água destilada. Congelar alíquotas a -20 ° C para armazenagem de curta duração.
  2. Dilui-se uma alíquota de anti-AMPc-criptato e uma alíquota de cAMP-D2 separadamente em tampão de lise de acordo com as instruções do fabricante para fazer soluções de trabalho.
  3. Add 10 ul / poço de solução de trabalho de anti-cAMP-criptato e 10 ul / poço de solução de trabalho de cAMP-D2 para a placa de 384 poços com uma pipeta multicanal.
  4. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente, e incubar à temperatura ambiente durante 1 hora.
  5. Leia a placa em um leitor de placas de fluorescência (configuração de escala automática para a sensibilidade) com uma excitação de 337 nm e medir as emissões em 620 nm e 665 nm por instruções do fabricante.
  6. Aplicar análise raciométrica para avaliar curva padrão cAMP por instruções do fabricante. Usando os valores resultantes, extrapolar a acumulação de AMPc estimada nos poços de teste, utilizando o software de análise de dados.

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Resultados

Parte I. Desenvolvimento de um ensaio de sensibilização bem heterólogo 384 para a identificação de inibidores de moléculas pequenas utilizando um modelo de células comercialmente disponível.

Estudar sensibilização heteróloga em um modelo de celular, fizemos uma série de melhorias que nos permitiu agilizar o ensaio em um formato "misturar e ler". Várias das modificações principais são destacadas a seguir, e são descritos em mais pormenor na discussão. O primeiro pas...

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Discussão

Em um esforço para facilitar os estudos de sensibilização heteróloga, temos extensivamente modificado nosso método anterior alcançar uma simplificada "mix e ler" formato que pode ser alterada a seleção de alto rendimento e mecanismo de exame ação. As modificações importantes nosso protocolo pode ser resumido como se segue: 1) o uso de células criopreservadas como reagentes de ensaio "pronto", 2) a miniaturização do ensaio em formato de 384 poços, e 3) a utilização da medição de HTRF cAMP.

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer o Sr. Richard Zink e Todd Wiernicki para treinamento e orientação metodológica ensaio. Agradecemos também a John Paul Spence para a leitura cuidadosa e sugestões editoriais. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, e Eli Lilly and Company por meio do Programa de Pesquisa Prêmio Lilly (LRAP).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células CHO-K1-DRD2LDiscoveRx930579C2
Ham' s F12 mediaVWRSH30026fs
Fetal Bovine SerumVWRSH3007003
G418SigmaA1720
HygromycinFisher50-230-5556
Penicilina/estreptomicinaLife Technologies15070063
pratos de 15 cmBD Falcon353025
DMSOSigmaD2650
Tampão de dissociação celularLife Technologies13150016
tampão fosfato SalinoFisher
976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
TC tratadas com placas de 384 poçosPerkin-Elmer6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kitCisbio Bioassays62AM4PEBhttp://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prism 6GraphPad SoftwareNA
3-Isobutil-1-metilxantinaSigmaI5879
(±)QuinpiroleSigmaQ111
SpiperoneSigmaS7395
ClozapinaSigmaC6305
HaloperidolSigmaH1512
S-(-) SulpiridaSigmaS112
Lipofectamina 2000 reagente de transfecçãoInvitrogen11668019
Trypan azulVida TecnologiasT10282
livre de água, DNase e RNaseBiomedicals821739
Gas siRNA siRNApersonalizado
Dharmacon Controle de siRNA não direcionadoDharmaconD-001206-14-20
siGlo RedDharmaconD-001630-02
Cryovials MP

Referências

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