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DOI:

10.3791/51241

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12 de junho de 2014

 ,  , 
1Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, UMR-6265 CNRS, 2Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, UMR-1324 INRA, 3Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, Université de Bourgogne

Neste artigo

Resumo

Apresenta-se um teste de escolha para revelar a influência de odorantes sobre o comportamento de Drosophila, utilizando um ensaio de Y-labirinto.

Resumo

A detecção de sinais a partir do ambiente é essencial para animais para garantir a sua sobrevivência. Para este fim, eles usam estímulos ambientais, tais como a visão, mechanoreception, audição e chemoperception através de gosto, através de contato direto ou através do olfato, que representa a resposta a uma molécula volátil atuando em uma escala mais longa. Moléculas químicas voláteis são sinais muito importantes para a maioria dos animais na detecção de perigo, de uma fonte de alimentação, ou para comunicação entre indivíduos. Drosophila melanogaster é um dos modelos biológicos mais comuns para os cientistas a explorar a base molecular e celular do olfacto. A fim de destacar as habilidades olfativas deste pequeno inseto, nós descrevemos um protocolo escolha modificado com base no teste Y-maze classicamente utilizada com camundongos. Dados obtidos com Y labirintos dar informações valiosas para entender melhor como os animais lidar com seu ambiente perpetuamente mudando. Introduzimos um protocolo passo-a-passo para estudar oimpacto de odores sobre a resposta exploratória mosca com este ensaio Y-labirinto.

Introdução

Quimiorecepção através de gosto ou olfato é uma modalidade sensorial chave para a sobrevivência animal. Dá sinais vitais necessários para a detecção de um perigo ou fontes de alimentos, bem como para as interacções sociais. Ela também ajuda os animais a encontrar um parceiro necessário sexo para a sua reprodução. Por mais de 20 anos, a pesquisa intensiva, incluindo Nobel premiado trabalho de Richard Axel e Linda Buck, em 2004, "por suas descobertas de receptores olfativos ea organização do sistema olfativo", foi realizado para revelar as bases moleculares e celulares da olfato 1,2.

Um dos modelos animais favoritos para os cientistas para dissecar percepção olfativa é D. melanogaster. Este inseto compartilha uma estratégia de codificação odor-celular e molecular semelhante com mamíferos. A comunidade científica utiliza diversos paradigmas comportamentais para estudar o papel dos odores nesta mosca da fruta. Estes ensaios incluem ensaios multimodais, tais como courtshitestes p onde várias modalidades sensoriais, incluindo o olfato, são importantes para suscitar namoro masculino 3. Outros ensaios também foram desenvolvidos para lidar com o papel de odores mais especificamente; estes incluem t-labirintos, Y labirintos, ensaios de armadilha, arenas de quatro de campo e vento túneis 4.5.6.7.8.

Neste artigo apresentamos um ensaio simples modificado Y-labirinto, que fornece respostas olfativas robustas usando D. melanogaster. O nosso set-up usa finais dicas em contrário a um método previamente descrito 9. Assim, o nosso Y-maze tem duas vantagens. Primeiro, ele evita qualquer retorno no sistema uma vez que a mosca fez sua escolha. Em segundo lugar, limita a troca de odores em todas as áreas do Y-labirinto. Esta última vantagem é importante uma vez que a Drosophila são muito sensíveis ao fluxo de ar, que é muitas vezes utilizado para evitar a saturação do odorante. Para ajustar o set-up experimental com um fluxo de ar seria o tempo eo custo de consumir. Por isso, o nosso ensaio de labirinto Y-representa um efciente e maneira rápida de testar o desempenho olfativo de Drosophila.

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Protocolo

1. Antes de Começar

  1. Use um estoque de referência isogenized tendo fenótipos comportamentais estáveis ​​e robustos. Não existe uma regra geral para a escolha deste estoque, uma vez que todos os controles potenciais podem levar fundo heterogêneos alelos.
  2. Use esta estirpe de controlo para todos os outros retrocruzamento estoque necessário para etapas posteriores. Esta etapa retrocruzamento é normalmente representado por pelo menos cinco cruzamentos sucessivos de uma única fêmea virgem (para permitir possível crossing-over entre cromossomos homólogos) para 2-3 machos referência isogênicos 5. Este passo é importante para homogeneizar o fundo genético entre as diferentes ações de voar.
  3. Manter stocks de Drosophila em uma farinha de milho normal (9%), levedura de cerveja (10%), e meio de agar (1,5%) complementado com antibióticos (0,4% metil-para-hidroxi-benzoato de metilo) num ciclo de luz / escuro de 12 horas a 25 ° C.
  4. Alcançar experimentos quimio em uma sala com temperatura controlada (25 ° C) sob luz vermelha extrema(Para eliminar a contribuição de sugestões visuais, e se concentrar em sinais de quimio). Regularmente renovar o ar do quarto para ventilar a área entre cada experimento.

2. Olfatório resposta utilizando um Ensaio Y-maze

  1. Starve as moscas de 16-18 horas a 25 ° C em tubos de vidro contendo uma toalha de papel húmido antes do teste.
  2. Junte-se um conector em forma de Y para dois frascos de vidro e de um frasco de plástico inferior (carregamento frasco). Use 1 ml pontas de pipeta que passam as rolhas de espuma de ligação do conector para as três taças, e para obter um hermeticamente fechado Y-labirinto. Corte as pontas estreitas de dois pontas de pipeta (~ 2 mm de diâmetro, para evitar qualquer retorno da mosca uma vez que tenha feito a sua decisão) para formar dois frascos "armadilha", e um grande fim de uma ponta de pipeta para formar o "carregamento" tubo (Figura 1A).
  3. Pouco antes de conectar os frascos "trap" (Figura 1B), coloque uma ~ 6 milímetros de diâmetro em papel de filtrocada frasco. Adicionar 40 ul de solução de odorante sobre um papel de filtro, e 40 ul de solvente correspondente sobre o segundo papel de filtro.
  4. Apresente dez 4-9 moscas dias de idade para o frasco "carregamento". Não use dois anestesia CO durante esta transferência, uma vez que tem um forte efeito sobre o comportamento 10. Prefere usar breve resfriamento em gelo. Manipulação adequada de moscas anestesiados é importante limitar o estresse sobre os assuntos, tanto quanto possível.
    1. Realizar uma série de testes de Y-maze, a 25 ° C sob luz vermelha distante (usando lâmpadas LED para limitar possível fonte de aquecimento) para evitar estímulos visuais, tanto quanto possível. Tenha o cuidado de alternar as orientações dos Y labirintos (odorante contendo tubo à esquerda, ou à direita, e tubo de carga na frente ou na parte de trás; Figura 1C).
    2. Permitir várias horas para as moscas a entrar na armadilha frasco contendo o odorante ou o solvente. Contagem moscas após 24 horas para aumentar a participatina-se a mais de 80% e fornecer o valor máximo do índice olfactiva (Simonnet, comunicação pessoal).
    3. Calcular o índice olfactiva resultante utilizando a seguinte fórmula: (número no tubo odor - número no tubo de solvente) / número total de moscas carregados.
  5. Wash Y-maze set-up da seguinte forma: mergulhe a desmantelado set-up na RBS 35 MD durante a noite. Lave bem com água da torneira. Lavar com água deionizada e deixar secar.

3. Análise estatística dos dados

  1. Realizar um teste t, um one-way ANOVA ou ANOVA de duas vias, dependendo dos dados e variáveis.

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Resultados

A Figura 1D mostra dois respostas representativas utilizando este ensaio Y-labirinto. Canton-S machos evitar fortemente a 10% de ácido acético diluído, em água destilada, enquanto eles não evitar significativamente o ácido fenilacético 10%. Estes ensaios são baseados em 10 machos por repetição colocados juntos nos frascos de carregamento. Este protocolo pode levar a grande erro padrão da média. Se necessário, é possível reduzir este inconveniente, usando 20 machos por repetições em vez de apenas 10. Mat...

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Discussão

Nosso protocolo Y-maze baseia-se num protocolo anteriormente descrito 9. No entanto, apresentamos duas grandes diferenças. Primeiro, usamos pontas de pipeta estreitas para evitar que as moscas de retornar uma vez que eles decidem entrar no frasco que contém o solvente ou o solvente mais o odorante. Estas pontas estreitas também são úteis para limitar a difusão odorante no Y-labirinto. Em segundo lugar, nós usamos um frasco menor carga para forçar as moscas para entrar no Y-labirinto. É importante ter uma elev...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos 4 revisores anônimos por seu trabalho para melhorar o manuscrito. Agradecemos ao Centre National de la Recherche Scientifique pelo apoio financeiro para MBG e YG, ea Université de Bourgogne e do Ministério da Investigação francês para MMS. Pesquisa no laboratório YG é financiado pelo Conselho Europeu de Investigação (ERC Começando Grant, GliSFCo-311403), a Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), o Conseil Régional de Bourgogne (Faber), eo CNRS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de poliestireno DrosophilaVWR europa734-225530 x 25 mm 
Labirinto em Y
Drosophila Tubo de borossilicatoDijon verre95 X 25 mm
Labirinto em Y
Rolha de espumaDutscher999038
Labirinto em Y
Conector em forma deY Europrix11020605
Labirinto em Y
100-1.000 µ l ponteiras de pipetaCorning4868Junte as seguintes ponteiras de pipeta ao conector em forma de Y. Corte 2 pontas de pipeta a 65 mm da extremidade larga e conecte a extremidade estreita (com um ∼ Abertura de 2 mm) a 2 frascos para injetáveis de teste. Essas aberturas limitarão as inversões de marcha assim que as moscas entrarem nos tubos que contêm os odores. Corte 1 ponta de pipeta a 35 mm da extremidade larga e conecte-a ao frasco de carregamento.
Lâmpada
LED Y-maze Far-RedRubin-Lacaque0RB180238625-630 nm
Ácido AcéticoSigma-Aldrich45725
Ácido FenilacéticoSigma-AldrichP16621
LeveduraSensient Sabores Estrasburgo1018880464
FubáeurogermFarine de maï s
ÁgarKalysHP-697-25
Metil hidroxi 4 benzoatoVWR 25605293
internacional

Referências

  1. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
  2. Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
  3. Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y. The smell of love in Drosophila. Front. Physiol. 4, (2013).
  4. Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
  5. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
  6. Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
  7. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
  8. Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
  9. Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
  10. Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
  11. Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
  12. Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).

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