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Avaliação da hiperalgesia induzida por morfina e analgésicos Tolerância em ratos usando térmicas e mecânicas nociceptivos Modalidades

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DOI:

10.3791/51264

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29 de julho de 2014

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1Biotechnology and Cellular Signalling, UMR 7242 CNRS, Université de Strasbourg

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos um protocolo para examinar o desenvolvimento da hiperalgesia e tolerância em ratos induzida por opióides. Com base na medição das respostas nociceptivas térmicas e mecânicas de animais naive e tratados com morfina, que permite quantificar o aumento da sensibilidade à dor (hiperalgesia) e diminuir na analgesia (tolerância) associada à administração de opiáceos crónica.

Resumo

Hiperalgesia e tolerância induzida por opióides influenciar severamente a eficácia clínica de opiáceos, analgésicos em animais e seres humanos. Os mecanismos moleculares subjacentes ambos os fenômenos não são bem compreendidos e sua elucidação deverá beneficiar a partir do estudo de modelos animais e para o projeto de protocolos experimentais apropriados.

Descrevemos aqui uma abordagem metodológica para a indução, gravação e quantificar hiperalgesia induzida por morfina, bem como para evidenciar tolerância analgésico, usando os testes de pressão rabo-de imersão e de cauda em camundongos selvagens. Como mostrado no vídeo, o protocolo é dividida em cinco etapas sequenciais. Fases de manipulação e de habituação permitir uma determinação segura da resposta nociceptiva basal dos animais. A administração de morfina crónica induz hiperalgesia significativa como mostrado por um aumento tanto em sensibilidade térmica e mecânica, em que a comparação do tempo de analgesia pratos após aguda ou reptratamento morfina eated indica claramente o desenvolvimento de tolerância que se manifesta por uma diminuição na amplitude da resposta analgésica. Este protocolo pode ser igualmente adaptado para ratinhos geneticamente modificados de modo a avaliar o papel dos genes individuais na modulação da nocicepção e analgesia da morfina. Ele também proporciona um sistema modelo para investigar a eficácia de potenciais agentes terapêuticos para melhorar a eficácia do analgésico opiáceo.

Introdução

Hiperalgesia induzida por opióides (OIH) e tolerância analgésica limitar a eficácia clínica de opiáceos em animais e seres humanos 1-3. O envolvimento de pró-inflamatória de 4,5 ou de pró-nociceptivos (anti-opióide) 6,7 sistemas são atualmente exploradas hipóteses. A elucidação dos mecanismos subjacentes OIH e tolerância exige uma combinação de in vivo e in vitro abordagens, usando modelos animais apropriados, protocolos experimentais e ferramentas moleculares.

Farmacologia comportamental é o paradigma dominante para monitorar e quantificar estados analgésicas e hiperalgésicos em animais de laboratório (ratos, camundongos). A aplicação de um estímulo nocivo (térmica, mecânica ou química) para uma parte do corpo conveniente (pata traseira, cauda) de que o animal leva a uma retirada defensivas que podem ser facilmente marcados.

Propomos aqui uma abordagem metodológica para a indução, gravação e quantificar OIH etolerância em ratinhos de tipo selvagem, utilizando os testes de pressão e de imersão de cauda-cauda. O procedimento permite uma determinação fácil, sensível e reprodutível de valores de resposta nociceptivos térmicos e mecânicos em ratinhos. Como demonstrado no protocolo de vídeo, ratinhos C57BL / 6 experimentar hiperalgesia significativo após a administração de morfina crónico e manter esta durante vários dias. Ambos os valores nociceptivos térmicas e mecânicas são significativamente reduzidos, em comparação com as medições da linha de base em animais ingênuos. Além disso, a instalação experimental permite monitorar, para além do desenvolvimento de OIH, a diminuição da resposta analgésica de morfina (tolerância). Dados apresentados suportam a ideia de que a hiperalgesia e tolerância pode envolver mecanismos celulares e moleculares comuns 8,9, embora isso seja contestado na literatura 1,10-12. Finalmente, este protocolo pode ser igualmente adaptado para camundongos geneticamente modificados, a fim de avaliar o papel de genes individuais na modulaçãoção da dor. Ele também proporciona um sistema modelo para avaliar a eficácia de potenciais agentes terapêuticos para melhorar os efeitos analgésicos opiáceos.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as orientações europeias para o cuidado de animais de laboratório (Directiva 86/609/ECC Comunidades Europeias Conselho) e as diretrizes éticas para a investigação da dor experimental em animais conscientes 13. Camundongos machos C57BL6 / N Tac (10 semanas, 25 - 30 g) foram alojados em um biotério institucional com uma equipe de atendimento responsável pela operação da usina de conformidade com as normas ambientais. Os animais foram alojados em grupos (máximo de cinco ratinhos por gaiola) sob um ciclo claro / escuro de 12 horas / 12 horas de luz a uma temperatura constante (21 ± 1 ° C), com livre acesso a comida e água. Todos os experimentos foram realizados no mesmo período do dia (10:00 - 16:00), utilizando um grupo de 16 ratos. Materiais e equipamentos específicos estão indicados na tabela de Materiais.

Um procedimento de cinco-passo para monitorizar morfina induzida por hiperalgesia e tolerância

O protocolo édivide-se em cinco etapas sequenciais (AE) durante um período de 15 dias, Figura 1.

. 1 Mice Handling (Passo A; d-7 para d-5)

  1. Lidar com ratos e habituá-los a entrar livremente no limitador. Esta etapa preliminar reduz o stress - minimizando assim qualquer confusão com analgesia induzida pelo estresse - e permite que os animais sejam acostumados com o investigador, manuseio e manipulação no limitador mouse. Cada rato é tratado com cuidado por 5 minutos a cada dia.

. 2 basal nociceptiva resposta (Passo B, d-d-4 para 1)

  1. Meça latências de retirada da cauda usando o teste de imersão da cauda (TIT):
    1. Regule o termostato para 48 ° C.
    2. Gentilmente introduzir o mouse para o limitador. Mergulhe a salientes 2/3 final de sua cauda para o banho de água e iniciar o cronômetro.
    3. Parar o cronômetro assim que o mouse se retira a cauda da água quente e registrar o tempo de latência (em segundos). Em diae ausência de qualquer reacção nociceptiva, a 25 seg de corte é utilizado para prevenir danos nos tecidos.
    4. Substituir o rato em uma gaiola e testar o próximo até ao fim da série.
    5. Repita as medições da resposta nociceptiva mais duas vezes, tendo as medições dos animais na mesma ordem. A latência da resposta nociceptiva (s) para cada rato é determinado como o valor médio de três determinações sucessivas.
  2. Meça respostas mecânicas usando o teste de pressão residual (TPT)
    1. Gentilmente introduzir o mouse para o limitador e posicionar sua cauda sob a ponta cônica do analgesímetro.
    2. Pressione o interruptor de pé para aplicar uniformemente a pressão crescente sobre a parte proximal da cauda até a primeira reação nociceptiva (lutando, chiado) ocorre. No momento em que o animal reage, gravar a força atual (em gramas) que provoca a resposta nociceptiva. Na ausência de qualquer reacção, um valor de 600 g de corte é utilizado para evitar a temitir danos.
    3. Repetir esta medida nas partes mediana e distal da cauda do rato da mesma. Um intervalo de pelo menos 30 segundos é observada entre as medidas em um determinado mouse para evitar adaptação ou preconceito stress. Substituir o rato em uma gaiola e testar o próximo animal até ao fim da série (isto é, todos os ratinhos são testados). O valor nociceptivo (g) para cada rato é tomado como o valor médio de três medidas (isto é, proximal, média e partes distais da cauda de cada animal).
  3. Teste nociceptivo Repeat (todos os procedimentos descritos no passo 2) nos dias subseqüentes, d-3 para d-1.

. 3 Medição de morfina Analgesia (Passo C; d0)

  1. Definir a melhor combinação de animais que permite a seleção de dois grupos (n = 8 por grupo) de ratos com valores médios nociceptivos estáveis ​​e comparáveis, o que modalidade nociceptiva (TIT ou TPT) é considerada. Este valor será tomado como o basalresposta nociceptiva de referência para grupos 'salinas' e 'Morphine' futuros.
  2. Medir o peso corporal de cada animal.
  3. Prepara-se uma solução de morfina (0,5 mg de morfina por ml) em soro fisiológico estéril (NaCl a 0,9%) para a administração subcutânea (5 mg de morfina por kg de peso corporal do animal).
  4. Medir a latência de resposta nociceptiva (tomado como ponto de tempo 0) para cada rato de ambos "Saline" e grupos "Morfina" no TIT (todos os passos em 2.1 acima). Em seguida, medir nocicepção no TPT (todas as etapas em 2.2 acima).
  5. Injetar morfina por via subcutânea (tipicamente 0,25 ml de uma solução / morfina ml 0,5 mg por 25 g de peso do rato) e solução salina (0,25 ml por cada 25 g de peso do rato) para o "morfina" e grupos de solução salina ', respectivamente.
  6. Meça os valores nociceptivos no TIT e TPT (todos os procedimentos descritos acima, sob os passos 2.1 e 2.2, respectivamente) ao longo de um curso de tempo (30 min intervanalgesia induzida por) ai) para avaliar a morfina (5 mg / kg:
    1. Depois de 30 min pós-injeção, medir a resposta nociceptiva (determinação único) para cada rato do "Saline" e grupos de Morfina ', usando o TIT então o TPT.
    2. Em seguida, medir valores de resposta nociceptiva (Tt e TPT) em todos os ratos em pontos de tempo (em horas): 1-1.5-2-2.5-3 e 3,5 após a injecção.

4 Crônica Tratamento Morphine - Morphine induzida hiperalgesia. (Passo D; d1 a d6)

  1. No Dia: d1
    1. Medir valores de resposta nociceptiva no TIT e TPT tal como descrito acima (etapas 2.1 e 2.2). Anotar cuidadosamente latências de retirada e os limites de pressão para cada animal.
    2. Prepara-se uma solução fresca de morfina tal como descrito no passo 3.2.
    3. Injetar morfina por via subcutânea (5 mg / kg de peso corporal) para todo o grupo "Morphine" e soro fisiológico (0,25 ml por cada 25 g de peso do rato) para o grupo 'Saline. Vamos ªe animais descansar até o dia seguinte.
  2. Em Dias: d2, d3, d4, d5 e d6 repetir as operações descritas no ponto 4.1

. 5 Evidência para a Tolerância Analgésico (Passo E; D7)

  1. Avaliar analgesia induzida por morfina de acordo com o paradigma curso de tempo já detalhado na Seção 3.

6. Aquisição de Dados e Análise Estatística

  1. Avaliação dos Valores de resposta basal nociceptivos (Etapa B)
    1. Calcular para cada dia (ao longo da d-d-4 para 1 ponto) a média ± SEM valores (n = 8) para as respostas nociceptivas basais como proporcionadas de TIT e TPT dentro do 'salino' e grupos de morfina.
    2. Lote significam valores basais nociceptivos como uma função do tempo (dias) para ambos os grupos a Figura 2.
  2. Análise de-curso Tempo Morphine Analgesia em Dias d0 (Passo C) e D7 (Passo E)
    1. Calcular, em cada ponto de tempo depois de morfinainjecção, a média ± valores SEM (n = 8) para as respostas nociceptivas a partir TIT oferecidas (em segundos) e TPT (em g) em cada grupo.
    2. Lote valores médios de resposta nociceptiva como uma função do tempo para a 'solução salina »e grupos de morfina no dia 0 e dia 3 Figura 7 Figura 5.
  3. Desenvolvimento de hiperalgesia induzida por morfina (Passo D)
    1. Calcular para cada dia (ao longo do período de tratamento de d0-d7) a média ± valores SEM (n = 8) para os valores de resposta nociceptiva basais como proporcionadas de TIT e TPT dentro do 'tratados com solução salina "' e grupos tratados com morfina.
    2. Lote valores médios de resposta nociceptiva basal em função do tempo (dias) para o 'tratados com solução salina "e grupos de tratados com Morfina' Figura 4.
  4. Evidência para a Tolerância Analgésico (Passos C e E)
    1. Determinar a partir de morfina e tempo-cursoXperiment realizada em d0 Figura 3, o valor do tempo (ou intervalo de tempo) para a morfina é necessária para induzir uma resposta analgésica máxima.
    2. Tomar este valor (geralmente 30 min), como o tempo de referência para estimar a d7 Figura 5, o valor da linha de base da nocicepção (grupo tratado com soro fisiológico) e a resposta analgésica efectiva (no grupo tratado com morfina) para a morfina aguda.
    3. Valores nociceptivos tomadas no ponto de tempo de 30 min a partir de experiências de cursos em tempo de morfina realizados no D0 e D7 para os grupos e tratados com morfina tratados com solução salina, são apresentados como histogramas Figura 6.
    4. Estatísticas: Analisar dados usando one-way de medidas repetidas ANOVA. Os fatores de variação foram o tratamento (entre os indivíduos) e tempo (dentro de assunto). Para verificar diferenças separadamente em cada grupo, com medidas repetidas ANOVA. As comparações entre dois grupos foram realizadas pelo teste t não pareado ou teste t pareado, quando apropriado.
  5. O nível de significância foi fixado em P <0,05. Todas as análises estatísticas são realizadas utilizando o Software Statview.

Resultados

Avaliação dos valores basais de nociceptivos de Naïve Mice (Etapa B)

TIT e TPT foram aplicados sequencialmente para todo o grupo de ratinhos (n = 16), proporcionando os valores médios de resposta nociceptiva. Melhor combinação de animais permitiram uma definição posteriori de dois grupos (n = 8) de ratinhos, designado por salina e morfina, que exibem valores basais semelhantes nociceptivos e estáveis ​​Figura 2. A equivalência de ambos os grupos é válida independentemente do teste nociceptivo ( TIT: Figura 2A; TPT: Figura 2B), que foi seleccionado.

Curso de tempo para Morphine Analgesia no Dia 0 (Passo C)

Morphine Analgesia foi avaliada após uma única injecção (subcutânea) de morfina (5 mg / kg) em ratos ingénuos usando tanto TIT Figura 3A e Figura 3B TPT. Em ambos os testes, análises estatísticas, com uma forma de medidas repetidas ANOVA REVEAl que haja uma interacção significativa entre tratamento e tempo para TIT (F (7, 98) = 72, p <0,001) e TPT (F (7, 98) = 31, p <0,001). TIT e dados TPT análises usando medidas repetidas ANOVA indicar que não há nenhum efeito de injecção de solução salina (F (7, 49) = 0,49, p> 0,05) e F (7, 49) = 1,85, p> 0,05, respectivamente, para TIT e TPT ensaios), ao passo que a injecção de morfina induz uma forte analgesia em ratos (F (7, 49) = 92,46, p <0,001) e F (7, 49) = 34,37, p <0,001, respectivamente, para os testes e TIT TPT). O efeito analgésico da morfina máxima foi alcançada após 30 min em TIT e após 60 min em TPT, em comparação com os controlos injectados com solução salina (p <0,001, teste t não emparelhado).

Administrações repetidas de morfina induz hiperalgesia em camundongos (Passo D)

Nociceptivos valores basais foram medidos a cada diaantes da administração de morfina ou salina (ver protocolo). Como mostrado na Figura 4, as administrações da morfina, uma vez por dia, durante um período de 6 dias de tratamento induziu uma significativa e diminuição progressiva da térmico (F (7, 56) = 11,6, p <0,001, ANOVA de medidas repetidas, Figura 4A) e mecânico (F ( 7,56) = 15,55, p <0,001, ANOVA medidas repetidas; Figura 4B) valores nociceptivos basais. Hiperalgesia desenvolveu-se rapidamente, uma vez que começaram a ser significativa no dia 1 em TIT (p <0,01, teste-t não emparelhado, em comparação com os controlos injectados com soro fisiológico) e no dia 2 em TPT (p <0,05, teste-t não emparelhado, em comparação com solução salina injectada controles).

Curso de tempo para Morphine Analgesia no dia 7, após Crônica Tratamento Morphine (Passo E)

No dia 7, os ratinhos que receberam a morfina ou injecções diárias de solução salina ao longo de um período de 7 dias (d0 para d6) foram examinados em TTI Figura 5A e Figura 5B TPT primeiro para os seus valores basais nociceptivos e, em seguida, para a sua resposta à morfina analgésica aguda (5 mg / kg, sc.). Em concordância com o desenvolvimento da hiperalgesia mostrado na Figura 4, o valor basal nociceptivo (tempo 0) de ratinhos que foram tratados cronicamente com morfina foi significativamente menor do que a de ratos de controlo injectados com soro fisiológico (p <0,001, teste t não emparelhado). Seguindo morfina aguda, a resposta nociceptiva do grupo tratado com morfina crónico significativamente aumentada, mas apenas ligeiramente ultrapassado o valor basal nociceptivo de ratos de controlo injectados com soro fisiológico medido a 30 min em TIT e TPT (p <0,01 e p <0,05, t não emparelhado -teste, respectivamente) e aos 60 min em TIT (p <0,05; teste t não emparelhado). A partir de 2 h após o tratamento com morfina, até ao final da experiência, as respostas nociceptivas retornou a valores inferiores aos dos ratos de controlo (p<0,001, teste t não emparelhado).

Comparação das respostas analgésicas máximas de Ratos à morfina antes (dia 0) e após tratamento crônico Morphine (dia 7).

Limiares nociceptivos apresentados na Figura 6 são de TIT (A) e TPT (B) realizada 30 minutos após a injecção de morfina ou salina, tal como ilustrado nas Figuras 3 (dia 0) e cinco (dia 7). Uma forte diminuição da analgesia da morfina foi observada em ratinhos após tratamento crónico morfina durante 7 dias em comparação com a resposta inicial de analgesia no dia 0 em ambos os testes nociceptivos (p <0,001 teste t emparelhado). Estes dados demonstram que a tolerância se desenvolveu em dor animais hipersensíveis.

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Figura 1. Uma criança de cinco passo proprocedimento para monitorizar a morfina induzida por hiperalgesia e tolerância. O protocolo é dividida em cinco etapas sequenciais (AE) durante um período total de 15 dias.

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. Figura 2 Definição dos valores basais nociceptivos resposta (Passo B, d-d-4 para 1). A imersão da cauda (TIT) (A) e a pressão da cauda testes (TPT) (B) são aplicados a todo o conjunto de animais a fim de avaliar os seus valores basais nociceptivos. Posteriormente, dois grupos de ratinhos (n = 8), referido como «Saline" e grupos "Morphine", são definidos de forma que eles apresentam valores médios nociceptivos estáveis ​​e semelhantes, qualquer que seja a modalidade nociceptiva que é considerado.

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Curso de tempo Figura 3. De analgesia morfina no dia 0 (Passo C) em TIT (A) e TPT (B). O valor de resposta nociceptiva basal de ratos foi determinada a cada 30 minutos após a morfina único (5 mg / kg, sc. ) ou injeções de solução salina. Os dados estão expressos como média ± SEM, n = 8 ratinhos por grupo. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, teste t não emparelhado, em comparação com o grupo controle.

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. Figura 4 Desenvolvimento de hiperalgesia após a administração repetida de morfina (Passo D; d1 d6). Nociceptiva O valor basal de ratos foi determinada por TIT (A) e TPT (B) uma vez por dia antes da morfina (5 mg / kg,sc.) ou a administração de solução salina. Os dados são expressos como valores médios ± SEM, n = 8 ratinhos por grupo. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 pelo teste t não emparelhado, em comparação com o grupo de controlo tratado com solução salina.

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Figura 5. Curso de tempo de analgesia morfina em morfina crónico ratinhos tratados no dia 7 (Passo E) em TIT (A) e TPT (B). Ratos que foram submetidos a tratamento crónico com morfina (pontos pretos) ou solução salina (triângulos brancos) desde o dia 0 até ao dia 6, no dia 7 recebeu uma única injecção de morfina (5 mg / kg, sc.) ou solução salina, respectivamente. A resposta nociceptiva de ratinhos foi determinado em cada 30 minutos após a injecção de morfina ou de solução salina. Os dados estão expressos como média ± SEM, n = 8 ratinhos por grupo. * P <0,05, ** P & #60; 0,01 pelo teste t não emparelhado, em comparação com o grupo de controlo tratado com solução salina. As barras de erro que não excedam o tamanho símbolos estão ocultas.

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Figura 6. Comparação das respostas analgésicas máximos de ratinhos para a morfina (5 mg / kg, sc.) Antes (dia 0) e após o tratamento de morfina crónico (dia 7). Valores aqui apresentados são a partir de experiências mostradas na Figura 3 e Figura 5. valores nociceptivos foram medidos usando TIT (A) e TPT (B) 30 min após a injecção de morfina ou de solução salina. Os dados estão expressos como média ± SEM, n = 8 ratinhos por grupo. *** P <0,001 pelo teste t pareado.

Discussão

Etapas críticas

A escolha do modelo de animal para medições de nocicepção

A variabilidade na sensibilidade nociceptiva e analgésico entre linhagens de camundongos foi examinado (comentários 14-16) comentários usando vários modelos de dor que diferem em sua etiologia (nociceptivos, inflamatória, neuropática), modalidade (térmica, química, mecânica), duração (aguda, tônico, crónica) e local de administração (injecção cutânea, subcutânea, visceral). Quando comparado com outras cepas, C57BL/6J ("J" para Jackson Laboratory) ratos tornou-se um modelo animal popular para estudos da dor como eles apresentam alta sensibilidade nociceptiva basal 17,18 e uma resposta analgésica moderada a opiáceos 14,19. Após o tratamento morfina crônica, eles também desenvolvem tolerância analgésico significativo 20,21, 21,22 e hiperalgesia dependência 20,23.

nt "> Aqui, os experimentos foram realizados em ratos C57BL/6N Tac (" N "para Instituto Nacional de Saúde e" Tac "para Taconics fazenda), que pertencem a um ramo separado da linhagem B6. Apesar de camundongos C57BL / 6 têm sido considerada, estudos recentes apontaram para intercambiáveis ​​significativas diferenças comportamentais entre C57BL/6J e C57BL/6N cepas 24. Em particular, a menor sensibilidade para os três subcepas C57BL/6N (incluindo o Tac) com uma dor aguda térmica pode ser considerado como um vantagem para testar este fenótipo.

Ratos machos foram seleccionados como a grande maioria dos estudos sobre a dor, utilizando ratinhos como modelo animal, são realizadas em machos juvenis 25. Em nossas mãos, forneceram dados robusto e reprodutível quando examinados a partir de analgesia ou hiperalgesia pontos de vista. Ocasionalmente, notamos uma tendência para as mulheres C57BL/6N para dar respostas mais variável, tanto no TIT e testes TPT. Embora esta observação poderefletir as variações naturais ligados ao status hormonal das fêmeas, os mecanismos gerais subjacentes diferenças sexuais na dor e analgesia ainda permanecem um assunto de controvérsia. Alguns aspectos deste debate quente será brevemente apresentado nos próximos "Limitações da técnica de 'seção.

Habituação Animais

Ratos foram os primeiros autorizados a se acostumar com a facilidade animal durante uma semana. Semelhante a qualquer outro estudo comportamental, o teste foi realizado após um período de 3 dias de aclimatação, (Figura 1, passo A). Como os testes nociceptivos são sensíveis ao estresse, primeiras medidas podem dar latências mais longas do que as posteriores, especialmente em camundongos não habituado 26,27. O passo de habituação permite também a obtenção de valores de resposta nociceptiva mais estáveis ​​dentro do mesmo dia e entre os dias Figuras 2 e 4. Para reduzir os efeitos circadianos sobre nociceptiva e analgésicosensibilidade 28,29, todos os testes foram realizados 10:00-16:00.

Seleção de testes nociceptivos

Testes nociceptivos usar térmica, mecânica, química ou estímulos elétricos (revisão 26,27,30. Sua escolha é crítica como diferentes modalidades nociceptivos podem ser processados ​​através de diferentes nociceptores e fibras 18,31,32.

Foi selecionado o teste de imersão da cauda (TIT) 33, uma versão modificada do teste de retirada da cauda clássica desenvolvido por D'Amour e Smith, 34, e o teste de pressão da cauda (TPT), adaptado de Randall e Selitto 35, como exemplos de térmica e modalidades mecânicos para estudar a analgesia induzida por morfina, hiperalgesia e tolerância em ratinhos. Ambos os testes têm sido amplamente utilizados em ratos. Uma vez cortado foi sistematicamente definido para evitar ou limitar o risco de danos nos tecidos.

Morphine-induçãoed analgesia, hiperalgesia e tolerância

Morphine, o agonista mu-opióide protótipo, foi selecionado aqui, pois é um potente analgésico e OIH-indutor, tanto em humanos e camundongos 1,2,36. A potência analgésica da morfina é conhecida por variar de acordo com estirpes de ratinhos, as vias de administração e formas nociceptivos. Em ratinhos C57BL / 6, a analgesia de confiança é normalmente obtido após injecções subcutâneas de morfina na gama de 1-20 mg / kg de dose de 14,21. Assim, optou-se por estudar analgesia aguda após uma única administração (sc) de morfina a 5 mg / kg, perto de seu valor de ED 50 (7-20 mg / kg) avaliou de nocicepção térmica 19,21.

Administração repetida de morfina é muitas vezes acompanhada com tolerância analgésica (evidenciado a partir de um desvio para a direita da curva de dose-resposta ou a partir de um decréscimo na amplitude da resposta analgésica ou duração) e hiperalgesia (sensibilidade exacerbada dolorosa para stimuli evidenciado a partir de uma diminuição do valor basal nociceptivo). Ambos os fenómenos adversos dependem estirpes de roedores, da natureza do composto de ópio, que é seleccionado e da sua dosagem, da duração do tratamento e em modalidades nociceptivos 21. Por exemplo, os paradigmas experimentais para o estudo de tolerância e hiperalgesia consistem na administração diária de alta e constante (20 a 40 mg / kg por dia) ou 22 de escalada (até 50 ou até 200 mg / kg) 20,21 doses de morfina. Dessa forma, promoveu o desenvolvimento de hiperalgesia e tolerância em ratinhos C57BL / 6 por meio de administração de morfina por dia (5 mg / kg; sc) durante um período de 8 dias. Esta dose de morfina foi moderada preferência sobre os mais elevados para um melhor uso clínica imitar.

Criação de TIT janela operacional

Uma possível armadilha em TIT pode estar relacionado com o papel da cauda na termorregulação de roedores 26,37. Como a temperatura ambiente é um fator chave na nociceptive variações de resposta, que deve ser mantida constante (aqui a 21 ° C) ao longo de 38 experiências. Intensidade de calor geralmente é configurado para detectar uma resposta nociceptiva dentro de 5 a 10 seg 27. Com efeito, latências maiores pode aumentar o risco para monitorizar os movimentos dos animais não relacionados com o estímulo nociceptivo, ao passo que os mais curtos pode reduzir o poder do diferencial de teste. Foram realizadas medições TIT a uma temperatura fixa de 48 ° C. Latência de retirada da cauda eram cerca de 9 segundos (valor nociceptiva basal) e variou de 4 seg (hiperalgesia) a 25 seg (analgesia máxima; cortadas). Em adição a razões de ordem prática, as medições de valores da resposta nociceptiva, a uma temperatura fixa, a priori, pode envolver o mesmo reportório de nociceptores e circuitos, facilitando assim a interpretação de dados.

Possíveis Modificações

Otimização da janela operacional TIT para analgesia e OIH MeasureMents

Ao focalizar uma resposta analgésica, valores basais baixos (maior intensidade de calor) pode favorecer a detecção de um atraso na resposta. Por sua vez, para enfrentar a conseqüência de um estímulo doloroso ou o desenvolvimento de OIH, os valores basais mais elevados (intensidade menor calor; aqui 48 ° C) pode facilitar a detecção de respostas mais rápidas Figura 4.

Embora tenham sido encontrados morfina a 5 mg / kg uma dose conveniente para induzir uma resposta analgésica robusta Figura 3 e para promover (com a administração repetida) hiperalgesia significativa Figura 4, a sua dosagem pode ser adaptada conforme mencionado antes (passo crítico: a analgesia induzida por morfina, hiperalgesia e tolerância). Por exemplo, doses mais baixas podem ser usadas para reduzir a amplitude da analgesia (evitando assim as limitações de corte), enquanto que doses mais elevadas podem ser escolhidos para acelerar o início da hiperalgesia e aumentar a sua amplitude.

Overall, otimização da "janela nociceptiva" deve ser adaptado para o fundo genético dos ratos em estudo e levar em conta a possibilidade de envolvimento de matrizes distintas de nociceptores e circuitos.

Agonistas opiáceos alternativos (fentanil, remifentanil)

Embora opiáceos mais clinicamente como alvo o receptor mu-opióides como agonistas, que diferem consideravelmente no que diz respeito às suas propriedades farmacológicas, tanto in vitro como in vivo. Por exemplo, remifentanil e fentanil, em contraste marcado com a morfina, se comportam como agonistas completos e promover a internalização dos receptores mu-opióides 39. Analgésicos opiáceos, tais como morfina e fentanil tem uma meia-vida na gama de 40 horas, enquanto remifentanil tem uma ultra-curta meia vida de vários minutos, 41. Em humanos, a melhor evidência para OIH é de pacientes que receberam opiáceos durante a cirurgia, incluindo a curto atuação compounds como remifentanil 2,42. Assim, fentanil e remifentanil podem ser ferramentas valiosas demais para estudar o desenvolvimento de hiperalgesia e tolerância em ratos, sob TIT e paradigmas TPT.

Modos alternativos de indução de OIH (crónica vs administração aguda)

OIH é observada nos seres humanos e em modelos animais, como consequência da administração de opiáceos, mesmo a muito baixas ou muito altas dosagens de 1,2. Registramos aqui o desenvolvimento OIH após o tratamento crônico de ratos com doses moderadas de morfina. Vários dias de tratamento de ratinhos C57BL/6N foram necessárias para evidenciar uma hiperalgesia Figura estado claro e reprodutível 4 injecções diárias de morfina pode ser adequadamente substituído com pastilhas de morfina implantados:. Após a sua remoção, tanto a hiperalgesia térmica e alodinia mecânica foram já relatadas em murganhos 43. A infusão de opiáceos, através de uma bomba de micro-osmótico é outra possibilidade 44. Em roedores, a hiperalgesia de longa duração, também é viável a seguir a administração aguda de fentanil utilizando um protocolo que imita o uso deste agonista mu-opióide em cirurgia humana 36,45,46.

Limitações da técnica

As espécies animais e modelos para dor

Estudos comparativos de várias linhagens de camundongos fornecido evidências para grandes variações nas respostas aos estímulos nociceptivos doloroso 17,31,47 e nos níveis de OIH após o tratamento 4 dias morfina 22. Se mecanismos subjacentes processamento da dor e modulação em modelos animais (ratinhos e ratos) são relevantes para pacientes com dor crônica permanece uma questão fundamental e aberto. Assim, muito cuidado deve ser pago para a interpretação dos dados de animais e para a sua validade preditiva para os seres humanos 16.

Diferenças de género na dor e analgesia

ntent "> A maioria dos estudos pré-clínicos em modelos animais para dor foram conduzidos em roedores machos 16,25,48. Apesar deste viés de seleção, a visão emergente foi considerar os homens como melhores respondedores ao analgésicos opiáceos 49,50, menos propensas a desenvolver opióide hiperalgesia 51,52 e mais tolerantes à morfina analgesia 53 do que seus colegas do sexo feminino (54) revisão induzida. No entanto, as diferenças de sexo em relação a nocicepção e drogas analgésicas eficácia não retomar na tal "um tamanho único 'paradigma. fato, uma riqueza de dados agora indica que inúmeras variáveis ​​podem influenciar a magnitude ea direção das diferenças sexuais, como a eficácia de opióides de drogas e seletividade, ensaio nociceptiva, herança genética, idade, estado gonado-hormonal ou interação social 48,54. Nos seres humanos, a dor clínica é mais prevalente em mulheres, mas se este fato reflete as diferenças de sexo reais continua a ser uma questão de debate 48,55,56. For exemplo, a análise global de cinquenta ensaios clínicos não revelou diferenças significativas nas propriedades analgésicas entre os sexos enquanto meta-análise realizada em pacientes com controle assuntos apontou para um significativamente maior eficácia de opióides em mulheres 57. Esta última observação, o que contrasta marcadamente com o que tem sido encontrado em roedores, mais uma vez levanta várias questões sobre a origem de tais divergências 16,48,55,57. Ao todo, as diferenças sexuais na analgesia existem e mérito focar ainda mais em mecanismos subjacentes e implicações clínicas.

Sobre testes nociceptivos

O teste de retirada da cauda é um reflexo espinhal, mas pode ser sujeito a influências supra-58. TIT é relativamente fácil de executar em ratos, mas requer mais experiência em camundongos. Uma dificuldade potencial é manter o mouse em uma postura correta sem induzir estresse indesejado. O protocolo proposto pode ser ajustado de acordo comtamanho da coorte. 16 animais (8 Controle e 8 tratados) são facilmente gerenciados, tanto quanto a medição de seus valores basais resposta nociceptiva (usando TIT primeiro, depois TPT para toda a série de camundongos) está em preocupação. Monitoramento de cursos de tempo de analgesia requer o estabelecimento de um calendário preciso e avaliação do número máximo de animais que podem ser testadas (TIT primeiro, depois TPT), dentro do intervalo de tempo Comunicados (aqui 30 min). Todo o grupo de animais pode, assim, ser divididos em subgrupos para permitir que o experimentador a respeitar limitações cinéticas.

Importância da técnica com relação a / Métodos Alternativos Existentes

OIH em ratos contra rato

Os ratos têm sido amplamente utilizados para estudar analgesia opióide, hiperalgesia e tolerância, após a administração de opiáceos aguda ou crônica 46,59-61. Com efeito, por várias razões práticas, elas podem ser considerados superiores aoscamundongos como modelo animal para experimentos dor 16,61. No entanto, até há pouco tempo, a geração de ratos geneticamente modificados não era um procedimento simples. Como numerosas estirpes de ratinhos geneticamente modificados já estão disponíveis, o nosso modelo oferece a oportunidade para estudar a contribuição de numerosos genes individuais em OIH e desenvolvimento de tolerância em ratinhos.

TIT e TPT contra outros testes nociceptivos

TIT é uma variante do teste da ponta da cauda, ​​a diferença mais óbvia é a área da estimulação. Em contraste com calor radiante, por imersão da cauda em água quente conduz a um aumento rápido e uniforme na sua temperatura. Comparado com outras formas de teste de nocicepção térmica (testes de placa quente ou Hargreaves), TIT fornece resultados bastante reprodutíveis tanto entre e dentro de assuntos.

TPT é um teste muito popular para o estudo da nocicepção mecânica 26,27,35 que provavelmente envolvefibras nociceptivas distintas e transdutores moleculares então TIT 32. Ele fornece rápidas e confiáveis ​​medições de 59, mas requer alguns conhecimentos do experimentador e grandes grupos de animais. Como uma alternativa para o analgesímetro utilizado no presente estudo, outros processos e aparelhos contando com medidores de tensão que existe (avaliação 27). TPT é o mais adequado para o estudo da hiperalgesia mecânica enquanto filamentos de von Frey são normalmente tomadas para avaliar a alodinia mecânica (revisão 27).

Aplicações Futuras ou Directions depois de dominar esta técnica

O modelo OIH / tolerância experimental apresentamos aqui podem ser de forma semelhante adaptado para ratinhos geneticamente modificados de modo a avaliar o papel dos genes individuais na modulação da dor. Ele também fornece um sistema modelo para investigar a eficácia de potenciais agentes terapêuticos para aliviar a dor crônica.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS; Illkirch, França) por seu apoio.

Este trabalho foi apoiado pelo CNRS, INSERM, Université de Strasbourg, Alsace BioValley e por doações de Conectus, Agence National de la Recherche (ANR 08 EBIO 014.02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Comunidade Urbana de Estrasburgo (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direcção-Geral das Entreprises (Pharmadol).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
C57BL/6N Camundongos TacTaconic, Ry, DinamarcaC57BL/6N Tac B6-MCamundongos machos (25-30 g)
Cloridrato de morfinaFrancopia, Paris, FrançaCAS no. 52-26-6Entregue com autorização especial
Seringas (Terumo)Dutscher, Brumath, França050000Polipropileno, estéril, volume: 1 ml
Agulhas (Terumo)Dutscher, Brumath, França05010126 G ½ (Referência Terumo: NN2613RO1)
Conector de mouseFeito emDuas grades metálicas (5 x 11 cm) montadas com fita adesiva e grampos
Banho-maria termostatizado GR150Grant Instruments, Cambridge, UKGP 0540003
AnalgesímetroPanlab, Barcelona, EspanhaLE 7306
Software KaleidagraphSoftware Synergy, Reading, PA, USAKaleidagraph 4.03 Gráficos científicos
STATview softwaredownload gratuito, estatísticas
casa

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