Summary
継続的に成長しているマウスの門歯は、歯科上皮幹細胞（DESCs）から歯の組織の更新を研究するためのモデルを提供します。一貫して確実切歯からこれらの細胞を取得し、in vitroでそれらを拡張するための堅牢なシステムをここで報告されている。
Abstract
歯の再生と刷新の根底にある細胞および分子メカニズムを理解することは、大きな関心1-4の話題になると、マウスの切歯は、これらのプロセスのためのモデルを提供しています。この驚くべき器官は、動物の生涯を通じて継続的に成長し、（舌側）（唇側）唇と舌頚椎ループ（CL）領域内に収容された成体幹細胞のアクティブなプールから必要なすべての細胞型を生成します。唇CLからのみの歯科幹細胞は、唇表面のエナメル質、歯の外側カバーを、生成エナメル芽細胞を生じさせる。この非対称エナメル形成は切歯先端に擦り傷を可能にし、近位の切歯における前駆細胞や幹細胞は歯の組織が常に補充されていることを確認。 試験管内で 、これらの前駆細胞もしくは幹細胞を単離および増殖する能力は、その拡張を可能にし、例えばHなどの生体内では達成できない多くの実験、への扉を開きます潜在的な幹細胞調節因子のIGHスループット·テスト。ここでは記述し、マウスの切歯の唇CLからの培養細胞への信頼性と一貫性のある方法を示す。
Introduction
脊椎動物のユニークな特徴の一つは、歯の進化である。この器官に関連する分子経路及び形態学の専門分野が発達し、進化生物学者5によるものを含む、いくつかの観点から検討されているように歯は、研究の多くの分野のための重要なモデルシステムとなっています。より最近では、再生医療の分野は、モデルとしての歯を使用して貴重な洞察を得るために始めている。特に、歯科用上皮幹細胞の発見は、重要な進歩であった6-13。
すべてのげっ歯類は、その成長のこれらの歯の成体幹細胞制御を研究するためのアクセス可能なモデルシステムを作り、幹細胞によって支えられて継続的に成長している切歯を有する。遺伝系統トレース実験8,9,12,14が続き、1970年代10,11における標識実験は、DESCsは切歯の近位領域に存在することを明らかにした。ステム細胞唇子宮頸ループ（CL）として知られている推定のニッチの外唇側に移動、上の上皮の区画に子孫、およびトランジット増幅（TA）細胞（ 図1）と呼ばれる細胞の集団に貢献しています。具体的には、DESCsは、外エナメル上皮（OEE）に存在し、星状胞体（SR）8,9,14、および内エナメル上皮（IEE）は、細胞周期の限られた数を経て進行してから移動し、TA細胞を生じさせる遠位側切歯の長さ（ 図1）に沿って。マウス切歯で分化エナメル芽細胞は、1日15,16で約350ミクロンの驚くべき割合で切歯に沿って遠位方向に移動し続けています。彼らが移動すると、細胞が成熟したエナメル芽細胞と角質アラト（SI）の細胞に分化する。エナメルマトリックスの全層を堆積した後、エナメル芽細胞の多くは、アポトーシスを受け、残りのセルのサイズが縮小し、エナメル質の成熟を制御する<> 17 SUP。このようなSr等の唇のCLでの他の細胞型の系統は、それほど明確であり、間充織18内および舌のCLでの幹細胞に関するデータのみ出現し始めている。
マウス切歯モデルを使用して、グループの数は、遺伝的経路と自然の幹細胞に基づいた臓器再生に関与する細胞生物学的プロセスを解明するために取り組んできました。しかし、唇CLが困難な初代細胞での作業になり約5000のマウス切歯あたりと推定された細胞の数が比較的少なく、含まれています。そのため、努力が文化に作られ、 生体内で達成可能ではない実験的なアプローチに新たな扉を開くために体外 6,16,19,20 におけるこれらの細胞を拡大してきた。ほとんどの最近の研究は、これらの細胞が両方の自己再生および培養13発現細胞アメロゲニンに分化できることを実証した。ここでは、目のための方法を説明し、実証するマウス唇CLからの細胞のE信頼性と一貫性の文化。
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Protocol
1。成体マウスから低ヘミ顎を分析
- このプロトコルを実行する前に、必要な制度の承認を得て、すべての動物保護ガイドラインに準拠するようにしてください。標準動物実験委員会の手続きを承認用いて動物を安楽死させる。この作業のために、CO 2窒息頸椎脱臼に続いて使用されました。
- オプション：カミソリの刃を使用して、身体の残りの部分とは別のヘッド。
- ネックラインに下唇から肌を削除します。
- メスを用いて、緩く接続されている2下の切歯の間の切開を行います。圧力を加える際に、下顎は、2つの半分に分割される。
- あごを切り離す顎の顆および時間的な下顎関節や顎の筋肉と一緒にカット間のメスをウェッジ。
- 骨だけが残るまで、すべての筋肉、腱、靭帯を削除します。
2。切歯を隔離
- ＃15メスを用いて、慎重に膜状領域の近位端に遠位端から45°の角度で骨を削り取る。エッジでの骨片を含む任意の残りの骨を離れて選ぶ、メスの先端を使用してください。ゆっくりとわずか3 番目の臼歯の下に始まり、下顎骨の舌側皮質板で離れピックアップし始める。
- 切歯はClを含む領域に向けて慎重に作業し、きれいになるまで続ける。
- 下歯槽神経束を取り外します。
- 最初のCLに近位骨や組織を除去するクリーンなカットを作る。
- およそ2 番目の臼歯の下に、メスで遠位側に第二のカットを行います。近位切歯領域が、その後の骨と近位切歯の内側表面との間にメスを挿入して切開されています。組織を引き裂くしないように、これは慎重に行う必要があります。切開運動は、近位 - 遠位である。
ALTERNATIVEステップ：
私の上の領域に沿って可能な限り多くの骨を除去するncisor。エリアがクリアされたら、慎重にCLの領域に近いエナメル部分を処理するためにサイズを5ピンセットを用いて全体の門歯を削除します。 - 低付着プレートに4℃で3〜4時間、1×PBS中の2％コラゲナーゼで解剖した組織（代替ステップ2.5のように、 図3Eのように孤立し、CL、または全体の切歯のどちらか）を配置します。 1月10日切歯のために、12ウェルプレートにウェルあたり100μlを使用しています。 10を超える切歯の場合は、6ウェルの低付着プレートにウェルあたり500μlを使用する。
3。顕微解剖唇頚椎ループ
- 冷たいDMEM/F12培地中のコラゲナーゼおよび場所からのCL領域を除去。
- サイズ5鉗子またはインスリン注射器（1 CC、28 G½）のいずれかを使用して、CLの下端部に慎重に引き抜いてください。上皮は無傷のまま間葉はバラバラになります。 CLと「翼状」構造として、横方向に拡張し、隣接する上皮が表示されます。
- 削除する両側にV字型の切開を行って、すぐに氷上に冷たいDMEM/F12中に置くことで、隣接する上皮から頂芽。
- 1.5mlマイクロチューブに集め、すべてのCLのために繰り返します。
- 標本をマイクロチューブをスピンダウンし、メディアを取り出し、100μlの細胞剥離溶液と交換してください。
- 37℃で30分間、細胞剥離溶液中で組織をインキュベートする
- 優しくピペッティング千μlの低接着性ピペットチップを使用して、単一細胞懸濁液を生成するために組織を解離する。細胞はまた、解離を達成するために、滅菌細胞濾過器に配置することができる。
- 組織培養プラスチック又は他の所望の材料で血球計数器、プレートで細胞を数える。
DESCsの4。初代培養
- 6ウェルプレート中の細胞をプレート1-6でのn×10 20の濃度でマウスEGF組換えタンパク質を補充したDMEM/F12から構成さDESC培地中で4細胞/ mlのμg/ mlの、25 ng / mlの1×B27サプリメント、および1％抗生物質溶液（ペニシリン、100 U / mlのストレプトマイシン、50μg/ ml）をFGFの濃度で組換えタンパク質。
- 5％CO 2 DESC培地1ml中で37℃で6ウェルプレートに播種した細胞を成長させる。細胞接着およびコロニー形成を可能にするために播種後5日間、初期の文化を乱すことがありません。
- 最初のメディアの変化のために、新しいメディアの半分の容量（500μL）と古いメディアの容量（500μL）の半分を交換してください。メディアを変更するときに、顕微鏡下でコロニーを確認してください。
- 最初のメディアが変更された後、2日ごとに（1-2）中にメディアを変更し続けています。メディアを変更するときに、顕微鏡下でコロニーを確認してください。
5。パッセージDESCs
- 培地を吸引し、細胞を洗浄し、事前に温めたPBSで3回。
- 食塩水に予め温め0.25％トリプシン-EDTAを添加し、デタッチDESCs 10〜15分間37℃でインキュベートする。
- 細胞を収集するための組織培養プレートに沿ってピペット優しく、トリプシンを中和するためにDESCメディアを追加し、15ミリリットルコニカルチューブ内の場所。
- 2分間800×gで細胞をスピンダウン。
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Representative Results
マウスヘミ-下顎骨の1つを連続的に成長切歯三大臼歯根付いた（ 図1A）を含む。すべての歯は、象牙質とエナメル質、歯冠の2鉱化コンポーネント（ 図1Aおよび1A '）で構成されています。切歯を収容2つのステム細胞ニッチは、唇および舌CL CLと呼ばれ、エナメル質は、唇側（ 図1A '）のみに形成されている。 DESCsは切歯エナメル質の形成に関与していると唇、CL、特にOEEとSR（ 図1A''）8,9内に収納されている。唇CLはまた、IEE、TA細胞を含み、SI（ 図1A''）。私たちの技術は、唇のCLのDESCsの解剖と分離します（ 図1（A）''）に焦点を当てています。KRT14-アクチンGFPは半下顎（ 図1B）のすべての上皮由来細胞をマークし、唇CLははっきりと見ることができますのthroぐふ下顎（ 図1B '、白矢印）。これは、すべての細胞型は、より高い倍率（ 図1Aを比較'及びB''）の下で同定することができることに留意すべきである。
唇CLからDESCsを単離するための手順を図2にまとめる。簡単に説明すると、ヘミ下顎第一動物から除去され、下顎の骨が唇CLを露出させるために除去され、次いで唇CLには、コラゲナーゼで処理する周囲の間葉から上皮を分離する。 CLは、顕微解剖細胞解離緩衝液で処理し、組織培養プレートに播種する。基礎となる顎骨から唇CLの分離（ 図3）とメディアの適切な量の添加は、それぞれ、単離およびコロニーの増殖のために必須である。この技術を用いて形成された小、タイト上皮コロニーは7日間（ 図4a）で表示され、これらは、2〜3週間（ 図4B）内の大きなコロニーに成長する。
図1。成体マウスの切歯のイラスト。（A）成体マウスヘミ下顎の鉱化部品、エナメル質と象牙質、歯、臼歯と切歯の2つのタイプを示す。 DESCsが収納されている近位切歯領域がAにハイライトされている」。（A '）2幹細胞のニッチ、唇および舌頚椎ループ（LACLおよびLiCl）、エナメル質を生成するエナメル芽細胞を示す近位切歯の矢状図であり、象牙質を形成する象牙芽細胞。もっぱらエナメル芽細胞前駆細胞を生成し、最終的にLACLは、外エナメル上皮を示す。（A''）''切歯エナメル質は、Aで強調表示されたフォームLACL、 （OEE）、星状小胞体（SR）、内側のエナメル上皮（IEE）、トランジット増幅（TA）領域、および角質アラト（SI）。 SRは、異なる密度を有する亜集団を反映するように青と濃いピンクに示されている。蛍光レポーターマウス、KRT14-EGFP/Actbを用いて子宮頸部のループ（B）の可視化。骨は、比較的自己蛍光であり、骨の除去は、その後簡単に切り出すことができる。（B''）子宮頸ループ（B '）と上皮の残りの部分を公開しOEE、IEE、TAを含む子宮頸ループのすべての構造及びSIを容易にするレポーター遺伝子を用いて可視化することができる。スケールバーのB '、B "= 2ミリメートル、B」=50μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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図2。マウス切歯のCLの解剖と分離の概要手順の模式図。 CLは、下顎切歯の近位端に配置されている。最初のステップは、CLそのままで門歯を露出させ、周囲の顎の骨を除去することである。次に、歯器官は、間葉から上皮への別個の単離及び2％コラゲナーゼに配置される。 4時間のインキュベーションの後、CLは手動で、切除された単一細胞に解離し、標準的な組織培養プレート上に培養した。
図3。基盤となるCLの領域を露出するために、マウスの下顎の骨の除去。解剖プロセスの骨の除去のためのビジュアルチェックポイントが示されている。（A）は、半下顎Aを表示しますFTERステップ1.5、筋肉、腱や靭帯が骨から削除されたら、（B）は 、CLを含む領域に向けて近位に移動し、わずか3 回目のモル下から始めて、骨の削除を開始する領域を示している。ステップ2.4で述べたように続いて、CLにすべての骨近位は、（C）を除去した。ステップ2.5で述べたように、骨の残りの部分を除去するための次の切開（D）に示されている。最後に、CL、ステップ2.6（E）に記載されているように残りの骨から除去される、拡大図（挿入図）。
図4。in vitroでの成功コロニー形成の代表的な結果。7日間培養めっき後DESCsのA.位相差顕微鏡、。タイトなコロニー形成が成功した上皮を示しisolatio無葉系汚染のn。スケールバー=400μmの。B.インキュベーションの10日後、コロニーは、サイズが大きく、細胞が、典型的な上皮石畳の形態を有している。 = 100ミクロンスケールバー。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
上皮細胞は、40年以上前に21〜24第一に成功培養し、さらに最近では、上皮幹細胞の正常な分離25〜27は、上皮生物学の知識を進んでいる。我々は、成体マウスの切歯のDESCs、歯の生物学とエナメル質の形成に重要な洞察をもたらす可能性を秘めている幹細胞の比較的代役集団を単離するためのプロトコルを報告している。このプロトコルは、最初は毛包28から上皮幹細胞の単離の以前の報告に基づいていた。多くのプロトコルは、上皮幹細胞を維持するために、フィーダー層、および血清を使用するのに対し、本手法では、フィーダーフリー、無血清のシステムです。しかし、我々の増殖培地は、EGF、FGF2およびB27サプリメントのカクテルを使用する必要がありません。 EGFは、長期未分化細胞29を保持するために使用されている。 B27とともにEGFおよびFGF2のカクテルは、培養毛包幹細胞27、およびBに、以前に使用された27広く培養30,31に神経幹細胞を維持するために使用される。また、先に組織培養プラスチック上に及びECMの様々な基材上にDESCsの生存率および増殖率特性を測定し、そして差異は、増殖率の19で検出されなかった。細胞は最大10継代19のために維持することができる。
我々は、理由上顎と比較して、除去の容易さから、この手順のためのより低い門歯を使用しています。隔離中の我々のプロトコルの中で最も重要なステップは、コラゲナーゼ、CLのきれいなマイクロダイセクションに配置する前に下顎の骨からのCL領域の完全な除去である。近位切歯は非常にデリケートですので、唇、CLの損失をもたらす可能性がある、解剖中にそれを損傷しないことが重要です。不完全な除去はlabialCLの残党とDESCsの下収量につながる。また、非Cの混入を回避することが重要であるL上皮細胞。上皮間葉から分離された後にこのように、きれいなV字状の切開は、隣接する上皮から唇CLを除去するためになされるべきである。最後に、1mlあたり4×10 1上の細胞の濃度で、これらの細胞をプレートし、最初のメディアの変更のために馴化培地の半分を残すことが不可欠である。
歯科研究に、このプロトコルの主な利点は、in vitroで DESCsの効率的な生産と操作を可能にすることである。マウス切歯がin vivoモデル7-9,12,32-34、 試験管内システムの開発として確立されているが生体内で実行することが困難な実験への扉を開くことで、歯科研究分野を進める。このシステムの利点は、容易に種々の培養条件で細胞を操作する能力は、単一あるいは複数のシグナル伝達経路を容易に標的化、およびTaの阻害または活性化を含むsiRNAまたは増殖因子を用いrgeted分子。このインビトロ系の下流の適用は、特に単一細胞レベルで、機能的および/ または機構の研究を行うために上記の技術を使用して、ならびに他の最先端の技術が挙げられる。
全体的に、 体外培養で DESCから収集された情報は、幹細胞に基づく歯のリニューアルの複雑さを解明するのに役立ちます。
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Disclosures
著者らは、開示することは、特別の利害関係はありません。
Acknowledgments
著者は、DESCの文化と初期支援する秀のping王に感謝します。著者は（ODKにK12-GM081266は、MGCに、K99-DE022059 AHJにK08-DE022377-02 OHに、そしてR01-DE021420）国立衛生研究所からの奨学金や助成金によって部分的に資金を供給している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel |
| Forceps straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
References
- Sharpe, P. T., Young, C. S.
- D'Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
- Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
- Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
- Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
- Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
- Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
- Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
- Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
- Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
- Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
- Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
- Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
- Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
- Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
- Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
- Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
- Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
- Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
- Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
- Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).
