Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

O objetivo geral deste procedimento é obter células para cultura do incisivo do camundongo, alça cervical labial de maneira confiável e consistente. Isso é feito dissecando primeiro a hemimandíbula inferior do camundongo adulto e removendo o osso que cobre a região da alça cervical. O segundo passo é isolar a região da alça cervical e separar o tipo de meen do epitélio.

Em seguida, a alça cervical é microdissecada. A etapa final é dissociar as células epiteliais isoladas. Em última análise, este vídeo é usado para mostrar o procedimento correto para o isolamento bem-sucedido de células da alça cervical labial.

Demonstrando o procedimento estaremos eu, os pós-doutorandos Kirsten, SEL e Jimmy Hu e ing Lee, um membro do corpo docente visitante aqui no laboratório Klein. Após a eutanásia do animal, remova a pele do lábio inferior até o decote. Em seguida, use um bisturi para fazer uma incisão entre os dois incisivos inferiores, que estão frouxamente conectados.

Ao aplicar pressão, a mandíbula será dividida em duas metades. Em seguida, coloque o bisturi entre o côndilo da mandíbula e a articulação mandibular temporal e corte ao lado do músculo da mandíbula para destacar a mandíbula após a palavra. Remova todos os músculos, tendões e ligamentos até que apenas o osso permaneça.

Agora, raspe cuidadosamente o osso em um ângulo de 45 graus da extremidade proximal até a extremidade distal da região das membranas. Use a ponta do bisturi para remover qualquer osso restante, incluindo os fragmentos ósseos na borda. Em seguida, comece lentamente logo abaixo do terceiro molar para remover a placa cortical lingual da mandíbula.

Continue a limpar. Trabalhe cuidadosamente ao redor da área que contém a alça cervical. Faça um corte limpo para remover primeiro o osso e os tecidos proximais ao cl.

Em seguida, faça um segundo corte distalmente com o bisturi aproximadamente abaixo do segundo molar. Depois disso, remova o feixe do nervo alveolar inferior. A região do incisivo proximal é então dissecada inserindo o bisturi entre o osso e a superfície medial do incisivo.

Isso deve ser feito com cuidado para não rasgar o tecido. Em seguida, coloque o tecido dissecado em 2% de colagenase em um XPBS por três a quatro horas a quatro graus Celsius em uma placa de baixa aderência para um a 10 incisivos. Use 100 microlitros por poço.

Em uma placa de 12 poços, e para mais de 10 incisivos, use 500 microlitros por poço em uma placa de baixa aderência de seis poços. Neste procedimento, remova a região CL da colagenase e coloque em meio D-M-E-M-F 12 frio. Em seguida, puxe suavemente a extremidade inferior do LC usando uma pinça ou uma seringa de insulina.

O mesênquima se desfará enquanto o epitélio permanecer intacto. Em seguida, o CL e o epitélio adjacente que se estendem lateralmente como uma estrutura da perna da asa serão visíveis. Remova o botão apical do epitélio adjacente fazendo uma incisão em forma de V em ambos os lados e coloque-o em DMMF 12 frio no gelo.

Repita imediatamente para todos os CLS e colete-os em um tubo de micro fuge de 1,5 mililitro. Em seguida, gire o microtubo com as amostras. Remova o meio e substitua-o por 100 microlitros de solução de descolamento de células.

Em seguida, incube os tecidos em solução de descolamento celular por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a palavra, dissocie os tecidos para produzir uma única suspensão celular, pipetando suavemente para cima e para baixo. Usando uma pipeta de baixa adesão de 1000 microlitros, conte as células com um hemocitômetro, coloque as células em cultura de tecidos, plástico ou outro material desejado.

Agora coloque as células em uma placa de seis poços de uma a seis vezes 10 das quartas células por mililitro. Em meio DESC Cultive as células banhadas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Não perturbe as culturas iniciais por cinco dias após o plaqueamento para permitir a adesão celular e a formação de colônias para a primeira mudança de meio.

Substitua 500 microlitros da mídia antiga por 500 microlitros da nova mídia. Verifique as colônias ao microscópio ao trocar o meio após a primeira troca de meio, troque com um a dois mililitros de meio a cada dois dias e verifique as colônias ao microscópio Quando estiver pronto para passar as células, aspire o meio e lave as células três vezes com PBS pré-aquecido. Em seguida, adicione o PREWARM 0,25% de tripsin EDTA em solução salina e incube a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos para que os DSCs se desprendam.

Em seguida, adicione o meio DESC para neutralizar a tripsina. Pipetar suavemente ao longo da parede da placa de cultura de tecidos para recolher as células e colocá-las num tubo cónico de 15 mililitros Após a palavra, centrifugue as células a 800 Gs durante dois minutos. Aqui é mostrada a visualização da alça cervical.

Usando um camundongo repórter fluorescente, o osso é relativamente autofluorescente. A remoção do osso expõe a alça cervical e o resto do epitélio, que pode ser facilmente excisado. Todas as estruturas da alça cervical podem ser facilmente visualizadas com o gene repórter.

Esta figura mostra os resultados representativos da formação de colônias bem-sucedidas in vitro. Esta imagem das DSCs é tirada sob o microscópio de contraste de fase após o plaqueamento e cultura por sete dias. A formação de colônias apertadas indica isolamento epitelial bem-sucedido sem contaminação mesenquimal.

Após 10 dias de incubação, as colônias são maiores em tamanho e as células têm uma morfologia típica de paralelepípedos epiteliais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e microdissecar a alça cervical e cultivar células-tronco epiteliais dentárias do incisivo de camundongo adulto.