Name: Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a isolar células-tronco epiteliais dentárias do incisivo de rato adulto usando dissecação e microdissecação. Este método confiável permite cultivar DESC para estudos de regeneração dentária.

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Os autores agradecem Xiu-Ping Wang ajuda inicial com culturas desconto. Os autores são financiados em parte por bolsas de estudo e bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (K99-DE022059 a AHJ, K12-GM081266 para MGC, K08-DE022377-02 a OH, e R01-DE021420 para ODK).

1. Dissecar mais baixos hemi-mandíbulas de rato adulto <ol><li> Antes de realizar este protocolo, obter aprovação institucional necessário e não deixe de cumprir com todas as orientações de cuidados de animais. Eutanásia animal utilizando padrão IACUC procedimentos aprovados. Para este trabalho asfixia com CO2 foi usado seguido por deslocação cervical. <ol><li> OPCIONAL: cabeça separada do resto do corpo usando uma lâmina de barbear. </li></ol></li><li> Retire a pele do lábio inferior para o decote. </li><li> Usando um bisturi, fazer uma incisão entre os dois incisivos inferiores, que são vagamente conectados. Mediante a aplicação de pressão, a mandíbula será dividida em duas metades. </li><li> Wedge o bisturi entre o côndilo da mandíbula e da articulação mandibular temporal e cortar ao lado do músculo da mandíbula para separar a mandíbula. </li><li> Remova todo músculo, tendão, ligamento e até que apenas o osso permanece. </li></ol> 2. Isolar o Incisivo <ol><li> Usando um bisturi n º 15, Cuidadosamente raspar o osso em um ângulo de 45 ° a partir da extremidade distal para a extremidade proximal da região membranoso. Utilize a ponta do bisturi para escolher qualquer distância osso remanescente, incluindo os fragmentos de osso no bordo. Lentamente começam a escolher afastado na placa cortical lingual da mandíbula, começando logo abaixo do 3 º molar. </li><li> Continue até que o incisivo é limpo, trabalhando com cuidado para a área que contém o CL. </li><li> Remover pacote do nervo alveolar inferior. </li><li> Faça um corte limpo primeiro remover o osso e tecidos proximal ao CL. </li><li> Faça um segundo corte distal com o bisturi, aproximadamente abaixo do 2 º molar. A região proximal incisivo é então dissecadas para fora através da inserção do bisturi entre o osso e a superfície média do incisivo proximal. Isto deve ser feito com cuidado, de modo a não rasgar o tecido. O movimento é incisão proximal-distal. PASSO ALTERNATIVA: Remover o máximo possível de osso ao longo da zona superior da incisor. Uma vez que a área é limpa, remova cuidadosamente incisivo inteiro usando um tamanho de 5 fórceps para lidar com a parte de esmalte mais próximo a região CL. </li><li> Colocar o tecido dissecado (ou CL isolado como na Figura 3E, ou incisivo inteira como no Passo alternativa 2.5) em 2% de colagenase em 1X PBS durante 3-4 horas a 4 ° C em uma placa de baixa aderência. Para 1-10 incisivos, utilizar 100 ul por poço de uma placa de 12 poços. Para maior do que 10 incisivos, utilizar 500 ul por poço de uma placa de 6 poços aderência baixa. </li></ol> 3. Microdissect the Loop Cervical Labial <ol><li> Remover região CL da colagenase e coloque em mídia DMEM/F12 frio. </li><li> Puxe na extremidade inferior do CL usando tamanho 5 fórceps ou uma seringa de insulina (1 cc, 28 L C); mesênquima vai desmoronar enquanto o epitélio permanece intacta. O CL eo epitélio adjacente que se estende lateralmente como uma estrutura de &quot;asa-like&quot; serão visíveis. </li><li> Removera gema apical do epitélio adjacente, fazendo uma incisão em forma de V de cada lado, e coloque imediatamente em DMEM/F12 frio no gelo. </li><li> Repita o procedimento para todos os CLs, recolher em 1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Gire para baixo tubo de microcentrífuga com exemplares, ao remover a mídia, substitua por 100 solução desprendimento de células mL. </li><li> Incubar os tecidos em solução de desprendimento de células durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Dissociar os tecidos para produzir uma suspensão única célula cuidado pipetando para cima e para baixo usando um 1000 mL de baixa aderência ponteira. As células também podem ser colocadas através de um coador de células esterilizado para conseguir a dissociação. </li><li> Contar as células com um hemocitómetro, na placa de cultura de tecidos de plástico ou outro material desejado. </li></ol> 4. Cultura primária de DESCs <ol><li> Células da placa em uma placa de 6 poços a 1-6 x 10 4 células / ml em meios DESC, a qual consiste em DMEM/F12 suplementado com proteína recombinante de rato de EGF numa concentração de 20 ng / ml, a proteína recombinante de FGF, a uma concentração de 25 ng / ml, suplemento B27 1X e solução de 1% de antibióticos (penicilina, 100 U / ml, estreptomicina 50 ug / ml). </li><li> Cultivar células plaqueadas numa placa de 6 poços, a 37 ° C em 5% de CO 2 em 1 ml de meio de desconto. Não perturbe culturas iniciais, durante 5 dias após o plaqueamento para permitir a adesão celular e formação de colônias. </li><li> Pela primeira mudança mídia, substitua metade do volume (500 mL) de velha mídia com metade do volume (500 mL) de novas mídias. Confira as colônias sob o microscópio quando mudar de mídia. </li><li> Após a primeira mudança de mídia, continuam a mudar mídia (1-2 ml) a cada 2 dias. Confira as colônias sob o microscópio quando mudar de mídia. </li></ol> 5. DESCs Passage <ol><li> Mídia Aspirar e lavar as células 3x com pré-aquecido PBS. </li><li> Adicionar pré-aquecida de 0,25% de Tripsina-EDTA em solução salina e incubar a 37 ° C durante 10-15 minutos para os DESCs para separar. </li><li> Adicionar mídia DESC para neutralizar a tripsina, Pipeta suavemente ao longo do tecido placa de cultura para recolher as células, e coloque em um tubo de 15 ml. </li><li> Gire as células a 800 xg por 2 min. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.

As células epiteliais foram primeiro cultivadas com sucesso ao longo de 40 anos, 21-24, e, mais recentemente, o isolamento bem sucedido de células estaminais epiteliais 25-27 avançou nosso conhecimento da biologia epitelial. Relata-se um protocolo para isolar o DESCs do incisivo do rato adulto, uma população relativamente pouco estudado de células-tronco que tem o potencial para produzir insights importantes sobre a biologia dental e formação do esmalte. Este protocolo foi inicialmente baseada em r...

Uma das características únicas dos vertebrados é a evolução dos dentes. O dente tornou-se um sistema modelo importante para muitas áreas de pesquisa, como as vias moleculares e especializações morfológicas relevantes a este órgão foram investigados a partir de várias perspectivas, inclusive no desenvolvimento e evolutivos biólogos 5. Mais recentemente, no campo da medicina regenerativa começou a obter informações valiosas usando o dente como um modelo. Em particular, a descoberta de células estaminais epiteliais dental tem sido um importante avanço 6-13. Todos os roedores possuem dentes incisivos de crescimento contínuo, cujo crescimento é alimentado por células-tronco, tornando estes dentes um sistema modelo acessível para estudar regulação de células estaminais adultas. Experimentos de marcação na década de 1970 10,11, seguido por linhagem genética experimentos de rastreamento 8,9,12,14, demonstraram que DESCs residem na região proximal do incisivo. A hasteprogénie celular no compartimento epitelial em movimento lateral vestibular para fora do nicho putativo, conhecido como o ciclo cervical labial (CL), e contribui para uma população de células chamadas células (TA)-amplificação de trânsito (Figura 1). Especificamente, DESCs residem no epitélio externo do esmalte (OEE) e retículo estrelado (SR) 8,9,14, eo epitélio interno do esmalte (IEE) dá origem às células TA que progridem através de um número limitado de ciclos de células e, em seguida, mover distalmente ao longo do comprimento do incisivo (Figura 1). Os ameloblastos diferenciação na incisivo rato continuar a mover-se distalmente ao longo do incisivo a uma taxa excepcional de cerca de 350 mM de um único dia 15,16. Como eles se movem, as células se diferenciam em ameloblastos maduros e estrato intermediário células (SI). Depois de depositar a espessura total da matriz do esmalte, muitos dos ameloblastos sofrem apoptose, e as restantes células diminuem de tamanho e regular a maturação do esmalte &lt;sup&gt; 17. A linhagem de outros tipos de células no CL vestibular, tal como o SR, é menos claro, e dados em relação às células estaminais do mesênquima e 18 da CL lingual só agora começam a surgir. Utilizando o modelo de ratinho incisivo, um certo número de grupos têm trabalhado para elucidar as vias genéticas e os processos biológicos envolvidos na renovação das células estaminais naturais com base em células de órgãos. No entanto, o CL labial contém um número relativamente pequeno de células, que se estima ser de cerca de 5,000 por incisivo do rato, o que facilita o trabalho com células primárias desafiando. Por conseguinte, têm sido feitos esforços para a cultura e expandir as células in vitro 6,16,19,20, a fim de abrir as portas para novos abordagens experimentais que não são atingíveis in vivo. O estudo mais recente mostrou que estas células podem tanto a auto-renovação e diferenciação em células que expressam amelogenina quando cultivadas 13. Aqui, descrevemos e demonstrar um método para poe cultura confiável e consistente de células do rato labial CL.

<table><tbody><tr><td>Fórceps, tamanho 5</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11251-30</td><td>FST por Dumont,</td></tr><tr><td>Fórceps Dumoxel reto, fino, 3.5</td><td>Roboz</td><td>RS5070</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear Serviços de</td><td>microscopia eletrônica</td><td>#71960</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi nº 3</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de penas nº 15</td><td>Serviços de microscopia eletrônica</td><td>#72044-15</td><td>Cirúrgico </td></tr><tr><td>Colagenase de aço inoxidável tipo 1 filtrada</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td> <td># 4214</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina</td><td>BD</td> <td># 329424</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>EMD Millipore</td><td>#SCR006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R & D</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>R& D</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Gibco</td><td>10889-038</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura da dental epiteliais células-tronco do adulto rato incisivo

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Compreender os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à regeneração do dente e renovação tornou-se um tema de grande interesse 1-4, eo incisivo rato fornece um modelo para estes processos. Este órgão notável cresce continuamente ao longo da vida do animal e gera todos os tipos de células necessárias de grupos ativos de células-tronco adultas alojados no vestibular (em direção ao lábio) e lingual (em direção à língua) regiões (CL) alça cervical. Apenas as células estaminais dentárias da CL labial dar origem a ameloblastos que geram o esmalte, o revestimento externo dos dentes, na superfície labial. Esta formação do esmalte assimétrica permite abrasão na ponta incisivo e progenitores e células-tronco no incisivo proximal garantir que os tecidos dentários são constantemente reabastecidos. A capacidade de isolar e cultivar essas células progenitoras ou tronco in vitro permite a sua expansão e abre as portas para inúmeras experiências não alcançáveis ​​in vivo, tais como htestes de rendimento igh de fatores de regulação de células-tronco em potencial. Aqui, descrevemos e demonstrar um método confiável e consistente para células de cultura do CL labial do incisivo mouse.

O mouse hemi-mandíbula é composto por um contínuo crescimento incisivo e três molares enraizadas (Figura 1A). Todos os dentes consistem de dentina e esmalte, as duas componentes mineralizados da coroa do dente (Figuras 1A e 1A &#39;). As casas incisivos dois nichos de células estaminais chamado o CL CL labial e lingual, e esmalte é formada exclusivamente no lado labial (Figura 1A). DESCs são responsáveis ​​pela formação do esmalte dos dentes incisivos e...

O contínuo crescimento incisivo do rato é um modelo para o estudo de renovação dos tecidos dentários a partir de células-tronco do epitélio dental (DESCs). Um sistema robusto para consistente e confiável a obtenção destas células a partir do incisivo e expandi-las in vitro é relatado aqui.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

O objetivo geral deste procedimento é obter células para cultivo a partir do incisivo do camundongo, especificamente do polo cervical labial, de maneira confiável e consistente. Isso é realizado primeiramente pela dissecação do hemimandíbulo inferior de um camundongo adulto e remoção do osso que recobre a região do polo cervical. O segundo passo consiste em isolar a região do polo cervical e separar o mesênquima do epitélio.Em seguida, o anel cervical é microdissecado. O passo final é dissociar e então cultivar as células epiteliais isoladas. Em última análise, este vídeo é utilizado para demonstrar o procedimento correto para o isolamento bem-sucedido de células do anel cervical labial.Quem demonstrará o procedimento serei eu, os pós-doutorandos Kirsten, SEL e Jimmy Hu, e ing Lee, um pesquisador visitante no laboratório Klein. Após a eutanásia do animal, remova a pele da região do lábio inferior até a linha do pescoço. Em seguida, use um bisturi para fazer uma incisão entre os dois incisivos inferiores, que estão fracamente conectados.Ao aplicar pressão, a mandíbula será dividida em duas metades. Em seguida, insira o bisturi entre o côndilo da mandíbula e a articulação temporomand

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma maneira rápida e robusta de isolar células-tronco adultas viável epiteliais da pele humana é descrito. O método utiliza a digestão enzimática da matriz de colágeno da pele, seguido por arrancar dos folículos pilosos e isolamento de células em suspensão simples ou fragmentos de tecido para cultura de células.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs)...

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

O método de cultura de órgãos do tipo Trowell tem sido usado para desvendar redes de sinalização complexas que governam o desenvolvimento dentário e, mais recentemente, para estudar a regulação envolvida nas células-tronco do incisivo de camundongos em crescimento contínuo. Modelos animais fluorescentes-repórteres e métodos de imagem ao vivo facilitam análises aprofundadas de células-tronco dentárias e seu microambiente de nicho específico.

Uso da cultura de órgãos do tipo Trowell para estudar a regulação de células-tronco dentárias

Este protocolo apresenta um método para a cultura e crescimento 3D de células semelhantes a ameloblastos em microgravidade para manter sua forma alongada e polarizada, bem como a expressão de proteínas específicas do esmalte. Condições de cultura para a cultura de construções de engenharia periodontal e órgãos pulmonares em microgravidade também são descritas.

Propagação de Células e Órgãos Dentários e Respiratórios em Microgravidade

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura dos queratinócitos orais derivados do paladar do rato adulto. Um método de avaliação utilizando imunostaining também é relatado.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos Orais Primários do Paladar do Rato Adulto

Aqui apresentamos um método modificado para o isolamento e cultura das células epiteliais gengival humanas adicionando o inibidor de Rocha, Y-27632, ao método tradicional. Este método é mais fácil, menos demorado, melhora as propriedades das células-tronco e produz um número maior de células epiteliais de alto potencial, tanto para o laboratório quanto para aplicações clínicas.

Isolamento e Cultura das Células Epiteliais Gengivais Humanas Primárias usando Y-27632

O protocolo atual apresenta um método rápido, eficiente e suave para isolar células únicas adequadas para análise de RNA-seq unicelular a partir de um incisivo de rato em crescimento contínuo, molar de rato e dentes humanos.

Isolamento rápido de células únicas de dentes humanos e de camundongos

O folículo dentário contém uma população epitelial e células mesenquimais. A população epitelial foi selecionada da população heterogênea de folículos dentário, proporcionando um meio de cultura distinto. As células epiteliais sobreviveram e formaram colônias em um meio livre de soro.

Isolamento de Células Epiteliais do Folículo Dental Humano

Apresentamos um protocolo para desenvolver culturas organoides epiteliais a partir do dente humano. Os organoides são robustamente expansíveis e recapitulam as células-tronco epiteliais do dente, incluindo sua capacidade de diferenciação de ameloblast. O modelo organoide único fornece uma ferramenta promissora para estudar a biologia dentário humano (células-tronco) com perspectivas para abordagens regenerativas dentárias.

Estabelecendo organoides do dente humano como uma poderosa ferramenta para pesquisa mecanicista e terapia regenerativa

O incisivo de camundongo contém valiosas células retentoras de marcação em seu nicho de células-tronco. Temos uma nova maneira de detectar e quantificar imparcialmente as células de retenção de marcação; nosso estudo utilizou marcação com EdU e uma abordagem de reconstrução 3D após a limpeza tecidual da mandíbula pelo PEGASOS.

Detecção e Quantificação de Células Retentoras de Marcação em Incisivos de Camundongos utilizando uma Abordagem de Reconstrução 3D após Limpeza de Tecidos

A imagem ao vivo ex vivo é uma técnica poderosa para estudar os processos dinâmicos de movimentos celulares e interações em tecidos vivos. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa microscopia de dois fótons para rastrear células epiteliais dentárias vivas em incisivos adultos inteiros cultivados.

Usando imagens ao vivo ex vivo para investigar divisões celulares e movimentos durante a renovação dentária de camundongos

Aprenda a isolar células-tronco epiteliais dentárias do incisivo de rato adulto usando dissecação e microdissecação. Este método confiável permite cultivar DESC para estudos de regeneração dentária.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

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