A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter

Resumo

Esta tecnologia de impressão microfluídica 3D imprime matrizes de células em superfícies submersas. Descrevemos como as matrizes de células são entregues microfluidicamente em células de fluxo 3D em superfícies submersas. Ao imprimir em superfícies submersas, foram produzidos microarrays celulares que permitem a triagem de medicamentos e a avaliação da citotoxicidade em várias áreas.

Resumo

A impressão de células para aplicações de microarray possui desafios significativos, incluindo o problema de manter o fenótipo celular fisiologicamente relevante após a impressão, má organização e distribuição das células desejadas e a incapacidade de fornecer medicamentos e/ou nutrientes para áreas-alvo na matriz. Nossa tecnologia de impressão microfluídica 3D é capaz de selar e imprimir matrizes de células em superfícies submersas de maneira automatizada e multiplexada. O design dos fluidos 3D da matriz de células microfluídicas (MFCA) permite que a ponta do cabeçote de impressão seja abaixada em um poço ou prato cheio de líquido e comprimida contra uma superfície para formar uma vedação. A ponta de silicone macia do cabeçote de impressão se comporta como uma junta e é capaz de formar uma vedação reversível aplicando pressão ou recuando. Outras tecnologias de impressão de células, como impressoras de pinos ou jato de tinta, não conseguem imprimir em aplicações submersas. A impressão de superfície submersa é essencial para manter os fenótipos das células e monitorar essas células em uma superfície sem perturbar as características da superfície do material. Ao imprimir em superfícies submersas, são produzidos microarrays celulares que permitem a triagem de medicamentos e a avaliação da citotoxicidade em uma infinidade de áreas, incluindo câncer, diabetes, inflamação, infecções e doenças cardiovasculares.

Introdução

Os recentes avanços na indústria farmacêutica têm levado a um interesse crescente no uso de microarranjos de celulares no processo de descoberta de medicamentos para a triagem de drogas e cytotoxicological ^1,2,3 análise. O desenvolvimento de ensaios in vitro de alto rendimento e métodos de rastreio utilizando microarrays de células facilitaria o desenvolvimento rápido e de baixo custo de candidatos da droga, bem como avanço a compreensão fundamental da célula ^1,4. A abordagem tradicional de triagem com células usa plataformas bem-placa convencionais; No entanto, esta abordagem é limitada devido ao custo elevado, o rendimento limitado, e uma capacidade limitada para fornecer informação quantitativa sobre a função das células ^{de 1,5.} Devido a essas limitações, a pesquisa em tecnologias de microarray celular é crescente para a caracterização molecular biológica, engenharia de tecidos, e droga triagem ^1,6. As vantagens de microarrays celulares incluem o uso de amostra menor, efeitos mínimos deheterogeneidade fenótipo celular mascarando informações, eo mais importante a capacidade de automatizar ensaios para mais aplicações de alto rendimento ^1,7,8.

A indústria farmacêutica utiliza atualmente de alto rendimento à base de células testes de rastreio com 2D culturas em monocamada de células para triagem de drogas em locais bem microplacas ^9. Células de multiplexagem em poços de placas de microtitulação oferece o potencial para um maior rendimento com opções de experimentação originais. Além disso, as actuais tecnologias de micromatrizes celulares permitem que as células para secar o que poderia alterar dramaticamente o fenótipo das células in vivo a partir de ^10,11. A fim de superar estes problemas, o MFCA foi concebido e é mostrado na Figura 1. O design dos fluidos MFCA 3D permite que a ponta da cabeça de impressão da Figura 1 a ser baixada para dentro de um banho e comprimida contra a superfície de modo a formar uma vedação. A ponta de silicone macio da cabeça de impressão se comporta como umjunta e forma uma vedação reversível. A tecnologia MFCA é adequada exclusivamente para fazer a interface com superfícies submersas, que é necessário para ambas as culturas de células e sistemas fatia do tecido, e é difícil ou impossível com a maioria das outras abordagens. Pinos ou impressão a jato de tinta não vai funcionar, e dispositivos microfluídicos 2D não são adequados para a deposição ou interface com grandes conjuntos de pontos discretos. Além disso, ao miniaturizar e localizando o experimento - microarray celular - o MFCA supera os principais problemas associados com a de alto rendimento à base de células de ensaios de rastreio.

O CFM utiliza redes de canais 3D para ciclo de pequenas amostras de fluido de volume mais localizações pontuais microscópicas em uma superfície de ^12,13. Ao imprimir com fluxo, biomoléculas, as células e os outros reagentes são mantidos em meio líquido durante todo o processo de impressão, permitindo a impressão de biomoléculas sensíveis e células, sem exposição ao ar, o que dificulta as técnicas de impressão de células actuais. É também possível imprimir directamente a partir de material em bruto, tais como sobrenadantes de hibridoma, ou, desde que exista um mecanismo de captura na superfície da matriz. O objetivo deste artigo é explicar em detalhes a impressão submersa de dois tipos de células em uma superfície.

Protocolo

1. Célula Preparação Cultura

1. Guarde os estoques celulares NIH/3T3 em nitrogênio líquido até que esteja pronto para uso.
2. Preparar meio completo para células NIH/3T3 utilizando Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, tampão HEPES 10 mM, 50 unidades / ml de penicilina, e 50 ug / ml de estreptomicina.
3. Descongelar as células para 2-3 min num banho de água com agitação a 37 ° C.
4. Ressuspender as células em 5 ml de meio completo e centrifugar a 1500 g durante 3 min.
5. Retirar o sobrenadante celular, sem perturbar o sedimento celular.
6. Ressuspender as células em 5 ml de meio e contar as células utilizando um hemocitómetro.
   1. Retirar 10 mL da suspensão de células e colocar num tubo de microcentrífuga de 0,5 ml.
   2. Adicionar 10 ul de azul de tripano para a suspensão de células e agitar com a ponta da pipeta.
   3. Pipetar 10 ul de células coradas para uma câmara de hemocitómetro.
   4. Contagem de células em hemocitómetro na 10xampliação.
      1. Contar as células vivas (bolas pequenas, brancas) para 4 dos 9 grandes praças. Só contar as células vivas que não aparecem azul escuro da mancha Trypan Blue.
      2. Calcula-se a média do número de células por quadrado grande, resultando em o número de células de ⁴ x 10 células / ml na suspensão inicial de células.
      3. Células de sementeira a uma densidade de 1 x 10 ⁵ células / ml, com um total de 5 mL em cada frasco T25.
   5. Células de cultura para entre 70% e 80% de confluência antes dos experimentos iniciais. Atualizar mídia a cada 2-3 dias ou quando necessário.

2. Printing Preparação da Superfície

1. Mark um rectângulo com marcador na parte inferior de uma tratados com cultura de tecidos de poliestireno (TCTPS) placa de 12 poços do tamanho da cabeça de impressão (7 mm × 19 mm).
2. Pipetar 50 mL de soro fetal bovino para a área retangular e espalhe-o sobre toda a região com a ponta.
3. Deixe a placa de Petrinum estéril biossegurança capuz O / N para permitir que o ponto de soro para secar completamente. Estas placas devem ser preparado não mais do que dois dias antes da utilização.

3. Impressão Submerso

1. Lavar a cabeça de impressão com água destilada.
   1. Encha uma 60 milímetros placa de Petri com água destilada e encaixar a cabeça de impressão para a superfície.
   2. Fluxo de água destilada através de cada uma das linhas de 2 min a 150 mL / min usando uma bomba pneumática.
   3. Descarte a água da placa de Petri e encha-o com água limpa.
   4. Mova a cabeça de impressão para cima e para baixo na água três vezes.
2. Encaixe o centro da cabeça de impressão sobre o local revestido de soro na pré-preparados placa de 12 poços.
3. Primeiro a cabeça de impressão com a mídia completas pré-aquecido, a 300 mL por canal.
4. Imprimir células suspensas a uma concentração de 50.000 células / mL sobre a superfície e 60 mL / min, 100 ul por canal.
5. Coloque a cabeça de impressão, deixou ancorado contra osuperfície, e o colector, num incubador de cultura de células definido para 5% de CO ₂ e 37 ° C durante 2 horas.
6. Após a incubação de 2 horas, remover a cabeça de impressão e colocar a tampa no prato de cultura. O momento em que a cabeça de impressão removido é considerado o ponto de tempo 0 h.

4. Cultura de Células Padrão

1. Adicionar 1 ml de meio pré-aquecido a uma das TCTPS de 12 poços da placa de soro-manchado, preparado no passo 2.
2. Tomar 1 ml da suspensão de células remanescente a partir do passo 2 e da pipeta num único poço de um de 12 poços TCTPS placa. Isto vai produzir uma cultura contendo 50.000 células no recipiente.
3. Colocar a placa de cultura de células dentro de uma incubadora a 37 ° C durante 2 horas.
4. Após a incubação de 2 horas iniciar a temporização,; para a consistência entre as amostras impressas e semeadura, este é considerado o ponto de tempo 0 h.

5. Visualization Cultura

1. Depois de 0, 2, 24, e 48 horas as células tomada de cada um dos dois métodos described acima e imagem usando um microscópio invertido padrão.
   1. Corar as células com iodeto de propídio, um corante vermelho fluorescente que apenas é incorporado no núcleo de células mortas.
      1. Lave as células 3 vezes com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato com cálcio e magnésio (PBS + +) para remover todos os detritos.
      2. Adicionar 1 ml de pré-aquecido PBS + + para cada recipiente de cultura.
      3. Adicionar 1 ml de solução de estoque de iodeto de propídio (1 mg / ml) a cada recipiente de cultura.
      4. Incubar as células coradas com iodeto de propídio a 37 ° C durante 10 min.
   2. Imagem as células usando um microscópio invertido em 10x e 40x.
2. Descarte as pilhas em um recipiente apropriado de risco biológico.

Resultados

As células NIH/3T3 de linha de células de fibroblastos foram semeados em impressos ou uma superfície submersa. As células foram cultivadas a uma densidade de 5 X 10 ⁴ culas por ml. As células foram semeadas utilizando técnicas de cultura de células tradicional. As células foram impressas utilizando uma grande formato, doze fluxo cabeçote célula, onde os canais são maiores (~ 500 mm) do que a utilizada para CFM proteínas e outras biomoléculas. As células foram semeadas ou impresso sobre uma superfície revestid...

Discussão

A tecnologia de impressão 3D microfluídicos aqui descrito é o único capaz de matrizes de impressão microfluidically de células em um líquido bem cheio, ou seja, uma superfície submersa. Ao imprimir sobre as superfícies submersas, microarrays de célula pode ser produzida que manter o fenótipo celular fisiologicamente relevante das células, bem como a capacidade para multiplexar as células no fundo de um único poço Figura 4. Os resultados deste estudo mostram que microfluidically impressão result...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microspotter de fluxo contínuo	Wasatch Microfluídica
NIH/3T3 células	ATCC	CRL-1658
Meio Eagle Modificado da Dubbleco	Invitrogen	11965-092	Meio de base para células
Tampão HEPES	Invitrogen	15630-080	Aditivo de mídia celular (pH de controle)
Piruvato de sódio	Invitrogen	11360-070	Aditivo de mídia celular
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen		Aditivo de mídia celular
Trypan blue	Invitrogen	15250-061	Célula de coloração para contagem
Hemocitômetro	Fisher	267110	Câmara celular para contagem de células
Nikon Eclipse TS100	Nikon		Usado para verificar células
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon		Usado para coletar imagens
Solução salina tamponada com fosfato (com cálcio e magnésio)	Invitrogen	14040-133	Enxágue as células antes da passagem e antes da coloração com PI
TrypLE Express	Invitrogen	A12177-01	Usado para remover células da superfície