Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Resumo

Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho para rapidamente analisar e explorar coleções de imagens de microscopia de fluorescência usando PhenoRipper, uma plataforma de análise de imagem recentemente desenvolvido.

Resumo

Apesar de rápidos avanços na microscopia de alto rendimento, ensaios baseados em imagem quantitativos ainda representam desafios significativos. Embora uma variedade de ferramentas de análise de imagem especializados estão disponíveis, a maioria dos fluxos de trabalho baseados em imagem-análise tradicionais têm curvas de aprendizado íngremes (para ajuste fino dos parâmetros da análise) e resultar em longos tempos de resposta entre imagem e análise. Em particular, a segmentação das células, o processo de identificação de células individuais de uma imagem, é um importante ponto de estrangulamento, a este respeito.

Apresentamos aqui, um fluxo de trabalho livre de segmentação de células-alternativo baseado em PhenoRipper, uma plataforma de software de código aberto projetado para a análise e exploração de imagens de microscopia rápida. O gasoduto apresentado aqui é otimizada para imagens de microscopia de imunofluorescência de culturas celulares e exige intervenção mínima do usuário. Dentro de meia hora, PhenoRipper pode analisar os dados a partir de um típico de 96 poços experimental e gerar perfis de imagem. Os usuários podemem seguida, explorar visualmente os seus dados, realizar o controle de qualidade em sua experiência, garantir uma resposta às perturbações e verificar a reprodutibilidade de repetições. Isso facilita um ciclo de feedback rápido entre análise e experiência, o que é crucial durante a otimização do ensaio. Este protocolo é útil não apenas como uma análise de primeira passagem para o controlo de qualidade, mas também pode ser usado como uma solução de ponta-a-ponta, especialmente para o rastreio. O fluxo de trabalho descrito aqui dimensionado para grandes conjuntos de dados, tais como os gerados por telas de alto rendimento, e tem sido demonstrado que grupos de condições experimentais pelo fenótipo com precisão ao longo de uma vasta gama de sistemas biológicos. A interface PhenoBrowser fornece uma estrutura intuitiva para explorar o espaço fenotípica e relacionar as propriedades de imagem para anotações biológicas. Tomados em conjunto, o protocolo descrito aqui vai diminuir as barreiras para a adoção de análise quantitativa de telas de imagem baseado.

Introdução

Ao longo da última década, os avanços rápidos na tecnologia de imagem têm dado muitos laboratórios a capacidade de realizar microscopia de alto rendimento. O desafio agora mudou de uma das imagens de uma das análises. Como podemos caracterizar, comparar e explorar a torrente de fenótipos ainda sutis complexas geradas por uma tela de imagem típico de alto rendimento?

Um número de imagem de análise e de informática plataformas deram usuários caixas de ferramentas sofisticadas ^1-3 para a extração de informação biológica de grandes coleções de imagens. No entanto, muitos obstáculos significativos permanecem na análise de dados de t....

Protocolo

1. Preparação de amostras e de imagem

1. Cultura celular
   1. Dividir culturas rotineiramente e manter a 20-70% de confluência. Um dia antes da experiência, crescer as células HeLa em DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium, ver Tabela de Materiais) e suplementado com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino) e 1x penicilina / estreptomicina.
   2. No dia do experimento, dividir células crescendo em cultura (cerca de 50% confluentes).
   3. Lavar as células com PBS (Tampão fosfato salino), expor a cerca de 2 ml de tripsina / EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) durante alguns segundos. Aspirar o excesso de tripsina / EDTA e manter as células banhadas por uma ....

Resultados

Aqui nós testamos a capacidade de fluxo de trabalho para este grupo de drogas com base no seu mecanismo de ação. As células HeLa foram semeadas em 30 cavidades de uma placa de 384 cavidades e coradas para ADN / actina / α-tubulina. Os anticorpos específicos primários, anticorpos secundários marcados fluorescentemente, e outras manchas fluorescentes que foram utilizados são listados na Tabela de Materiais. Os poços foram tratadas com 15 medicamentos pertencentes a três classes mecanicistas (inibindo histonadesacetilase, .......

Discussão

O fluxo de trabalho descrito aqui permite a caracterização e comparação de imagens de microscopia fácil e rápido. Primeiro, demonstrou como esse fluxo de trabalho pode ajudar a otimização experiência, por exemplo, realizando rapidamente o controle de qualidade em imagens de microscopia. Em seguida, demonstrou seu potencial para a análise de dados high-throughput screening: fomos capazes de drogas do grupo com base em seu mecanismo de ação. O agrupamento de drogas foi comparável à observada usando métodos mais complexos .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM, glicose alta	Invitrogen	11965	glicose alta, marcador de L-glutamina
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	Coloração de DNA, diluição 1:2.000 de estoque de 5 mg/ml
Marcador de faloidina-Alexa Fluor 488	Invitrogen	A12379	Falotoxina conjugada, diluição 1:200
Anticorpo primário &alfa;-tubulina	Sigma	T9026	Ab primário, camundongo monoclonal, diluição 1:200
Antivody secundário anti-rato TRITC	Jackson	115-025-166	Ab secundário conjugado, 0,5 mg em 1 ml de PBS + 1 ml de glicerol
Concentração de aldosterona			usada: 0,2 μ M
Concentração de Apicidina			usada: 20 μ M
Concentração de colchicina			usada: 0,16 μ M
Concentração de cortisol			usada: 0,2 μ M
Concentração de dexametasona			usada: 0,2 μ M
Concentração de docetaxel			usada: 0,2 μ M
concentração de M344			usada: 20 μ M
Concentração MS-275			usada: 5 μ M
Concentração de			usada: 0,3 μ M
Concentração de prednisolona			usada: 0,2 μ Concentração M
RU486			usada: 0,2 μ M
Concentração de Scriptaid			usada: 70 μ M
Concentração de taxol			usada: 0,3 μ M
Concentração de trichostatin A			usada: 0,2 μ M
Concentração de vinorelbina			usada: 0,3 μ O

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