Ensaiando proteosomal Degradação em um sistema de livre-Cell em Plantas

Resumo

Degradação de proteínas alvejado representa um grande mecanismo regulador para a função celular. Ela ocorre através da via de ubiquitina-proteassoma conservado, que se liga cadeias de poliubiquitina para a proteína alvo, que, em seguida, servir de "tags", como moleculares para o proteassoma 26S. Aqui, descrevemos um ensaio livre de células simples e confiável para a degradação de proteínas proteosomal.

Resumo

A via da ubiquitina-proteassoma por degradação proteica tem emergido como um dos mecanismos mais importantes para a regulação de uma grande variedade de funções celulares em praticamente todos os organismos eucarióticos. Especificamente, em plantas, o sistema de proteassoma ubiquitin/26S (UPS) regula a degradação de proteína e contribui significativamente para o desenvolvimento de uma ampla variedade de processos, incluindo a resposta imunológica, desenvolvimento e morte celular programada. Além disso, a evidência crescente sugere que vários patógenos de plantas, tais como Agrobacterium, explorar as UPS de acolhimento para a infecção eficiente, enfatizando a importância da UPS em interações planta-patógeno.

A especificidade do substrato da UPS é conseguido pela ubiquitina-ligase E3, que actua em conjunto com a E1 e E2-ligases para reconhecer e marcar as moléculas de proteína específicos destinados a degradação, anexando-os a cadeias de moléculas de ubiquitina. Uma classe das ligases E3 é o SCF (Skp1 / Cproteína Ullin / F-box) complexo, que reconhece especificamente os substratos UPS e tem como alvo os para ubiquitination através do seu componente de proteína F-box. Para investigar um papel potencial da UPS em um processo biológico de interesse, é importante elaborar um ensaio simples e confiável para a degradação de proteínas mediada por UPS. Aqui, nós descrevemos um tal teste, utilizando um sistema isento de célula de planta. Este ensaio pode ser adaptado para estudos sobre os papéis de degradação da proteína regulada em diversos processos celulares, com um foco especial sobre as interações proteína-substrato da caixa-F.

Introdução

A via proteassoma ubiquitin/26S está emergindo como um mecanismo generalizado para o controle de diversas reações biológicas, incluindo a regulação da transcrição, a progressão do ciclo celular e transdução de sinal, receptor infra-regulação ou endocitose, entre outros processos ^1-4. Nesta via, a proteína alvo é identificado pela ubiquitina resíduos que estão ligados através de uma primeira ligação thiolester a enzima activadora de ubiquitina E1 e translocados para um resíduo de aminoácido cisteína da enzima de conjugação da ubiquitina-E2 e, finalmente, E2 interage com ubiquitina ligase E3 , resultando em polyubiquitination do substrato de proteín....

Protocolo

1. A expressão de proteínas

1. A escolha do sistema de expressão
   Escolha do sistema, ou seja, vectores e um método de distribuição de vectores, os mais adequados para a expressão da proteína de interesse no modelo de organismo / célula específica. Note-se que o nosso ensaio requer a expressão das proteínas testadas em quantidades facilmente detectáveis, o que é melhor alcançada pela transformação transiente de um grande número de células. Em plantas, por exemplo, isto é melhor conseguido utilizando plasmídeos binários como os vectores de expressão e de Agrobacterium como sistema de entrega.
2. Construção de vectores de e....

Resultados

A Figura 1, adaptada do Zaltsman et al. ^17, ilustra experiências representativas para a detecção da degradação proteosomal em um sistema isento de células. Especificamente, nós demonstramos a desestabilização de uma planta relacionada com a defesa proteína VIP1 pela proteína F-box VBF pela via SCF ^VBF em N. benthamiana. VBF Arabidopsis e marcadas com HA VIP1 (HA-VIP1 proteínas) foram transientemente co-expressos, e o conteúdo de proteína HA-VIP1 dentro de.......

Discussão

Este ensaio baseia-se na expressão das proteínas testadas em tecidos de plantas, assim, o processo de degradação potencial proteosomal obviamente, já ocorre dentro dos tecidos vivos. Nós ensaio desestabilização da proteína, no entanto, apenas nos extratos, com o tempo de amostra de zero servindo como ponto de referência inicial. Por isso, nós definimos como um ensaio isento de células.

Um aspecto importante para o sucesso deste ensaio é a escolha correcta do vector de expressão a partir do q.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de ensaio de proteína	Bio-Rad	500-0001
Coquetel inibidor de proteinase	Sigma-Aldrich	S8820
Sistema Mini-Protean	Bio-Rad	165-8000
Sistema de eletrotransferência SD de western blotting semi-seco	Bio-Rad	170-3940
Affinity Purified Rabbit Anti-Ha	ICL Lab	RHGT-45A-Z
Conjugado de peroxidase IgG anti-coelho de cabra	Thermo Scientific	31460
BioTrace, NT membrana de transferência de nitrocelulose	Pall Corporation	27377-000
Substrato HRP quimioluminescente ocidental Immobilon	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
Lactacistina	Sigma-Aldrich	L6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate	Pierce	35055