É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Ensaiando proteosomal Degradação em um sistema de livre-Cell em Plantas

14.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/51293

⸱

26 de março de 2014

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University, State University of New York

Neste artigo

Resumo

Degradação de proteínas alvejado representa um grande mecanismo regulador para a função celular. Ela ocorre através da via de ubiquitina-proteassoma conservado, que se liga cadeias de poliubiquitina para a proteína alvo, que, em seguida, servir de "tags", como moleculares para o proteassoma 26S. Aqui, descrevemos um ensaio livre de células simples e confiável para a degradação de proteínas proteosomal.

Resumo

A via da ubiquitina-proteassoma por degradação proteica tem emergido como um dos mecanismos mais importantes para a regulação de uma grande variedade de funções celulares em praticamente todos os organismos eucarióticos. Especificamente, em plantas, o sistema de proteassoma ubiquitin/26S (UPS) regula a degradação de proteína e contribui significativamente para o desenvolvimento de uma ampla variedade de processos, incluindo a resposta imunológica, desenvolvimento e morte celular programada. Além disso, a evidência crescente sugere que vários patógenos de plantas, tais como Agrobacterium, explorar as UPS de acolhimento para a infecção eficiente, enfatizando a importância da UPS em interações planta-patógeno.

A especificidade do substrato da UPS é conseguido pela ubiquitina-ligase E3, que actua em conjunto com a E1 e E2-ligases para reconhecer e marcar as moléculas de proteína específicos destinados a degradação, anexando-os a cadeias de moléculas de ubiquitina. Uma classe das ligases E3 é o SCF (Skp1 / Cproteína Ullin / F-box) complexo, que reconhece especificamente os substratos UPS e tem como alvo os para ubiquitination através do seu componente de proteína F-box. Para investigar um papel potencial da UPS em um processo biológico de interesse, é importante elaborar um ensaio simples e confiável para a degradação de proteínas mediada por UPS. Aqui, nós descrevemos um tal teste, utilizando um sistema isento de célula de planta. Este ensaio pode ser adaptado para estudos sobre os papéis de degradação da proteína regulada em diversos processos celulares, com um foco especial sobre as interações proteína-substrato da caixa-F.

Introdução

A via proteassoma ubiquitin/26S está emergindo como um mecanismo generalizado para o controle de diversas reações biológicas, incluindo a regulação da transcrição, a progressão do ciclo celular e transdução de sinal, receptor infra-regulação ou endocitose, entre outros processos 1-4. Nesta via, a proteína alvo é identificado pela ubiquitina resíduos que estão ligados através de uma primeira ligação thiolester a enzima activadora de ubiquitina E1 e translocados para um resíduo de aminoácido cisteína da enzima de conjugação da ubiquitina-E2 e, finalmente, E2 interage com ubiquitina ligase E3 , resultando em polyubiquitination do substrato de proteína. Em última análise, as proteínas polyubiquitinated são reconhecidos e degradado pelo proteassoma 26S. Neste mecanismo, a enzima E3 especifica o substrato e funciona como o componente regulador chave do sistema de proteassoma ubiquitin/26S (UPS). Ligases E3 pode agir de forma independente, como ligases domínio RING, ou como parte de um SCF multisubunit (Sproteínas) complexo kp1/Cullin/F-box, tais como ligases de domínio F-box. SCF mediadas por vias de degradação proteosomal estão envolvidas na regulação da transcrição, do ciclo celular, a transdução de sinal 5-10 e muitas outras importantes funções celulares.

Além desses papéis críticos na regulação de processos celulares, UPS toma o palco central em muitas interações planta-patógeno. Por exemplo, a evidência crescente sugere que vários patógenos de plantas, incluindo Agrobacterium, contam com a UPS host para facilitar o processo de infecção 11. Agrobacterium provoca tumores neoplásicos em plantas, os quais representam os seus hospedeiros naturais, e também podem transformar uma vasta gama de outros eucariotas, a partir de fungos de 1,2 para as células humanas 12,13. Durante a infecção, Agrobacterium exporta um elemento de DNA (T-DNA) e várias proteínas de virulência (vir) na célula hospedeira 12-13. Uma dessas proteínas é VirF, a primeira proteína F-box encontradoa ser codificada por um genoma procariótico 14. Como parte do complexo de SCF ubiquitina-ligase, VirF, e seu homólogo funcional hospedeiro VBF 15, facilitar a infecção por Agrobacterium por meio da degradação de proteínas mediado por UPS, que presumivelmente facilita desencapsulamento de o T-DNA de bactérias invasoras dos seus acompanhantes e proteínas bacterianas hospedeiras, VirE2 e VIP1, respectivamente 16,17. Curiosamente, muitas proteínas F-box, incluindo VirF, são intrinsecamente instáveis ​​devido ao seu próprio proteólise, que é mediada pela actividade autoubiquitination 18,19 ou por outras ligases E3 para o qual as proteínas F-box podem servir como substratos 20-23.

Ao estudar actividades bioquímicas das proteínas F-box, outros ubiquitina ligases, e / ou os seus substratos, seria muito útil para empregar um ensaio simples e fiável para a degradação do proteossoma. Descrevemos aqui um tal protocolo para a análise da estabilidade da proteína na célula-Livre do sistema. Neste ensaio, a estabilidade do substrato UPS é analisada na presença ou ausência de um dos componentes essenciais da via de degradação do proteossoma, tal como uma proteína da caixa F, num sistema isento de células. Em geral, a expressão da proteína testada (s) em tecidos de plantas, preparação de extractos de células livres a partir destes tecidos e controlar as quantidades de proteína (s) de interesse por western blotting. O mecanismo dependente da UPS de degradação de proteínas é demonstrada pela inclusão de inibidores de proteossomo específicas e / ou da utilização de co-expressão de forma dominante negativa de um componente de SCF, Cullin. Considerando que ilustram este ensaio utilizando degradação proteosomal da proteína de Arabidopsis VIP1 17 pela proteína F-VBF caixa 15, que pode ser empregue para investigar a estabilidade de quaisquer outros substratos proteossomo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. A expressão de proteínas

  1. A escolha do sistema de expressão
    Escolha do sistema, ou seja, vectores e um método de distribuição de vectores, os mais adequados para a expressão da proteína de interesse no modelo de organismo / célula específica. Note-se que o nosso ensaio requer a expressão das proteínas testadas em quantidades facilmente detectáveis, o que é melhor alcançada pela transformação transiente de um grande número de células. Em plantas, por exemplo, isto é melhor conseguido utilizando plasmídeos binários como os vectores de expressão e de Agrobacterium como sistema de entrega.
  2. Construção de vectores de expressão binário
    O clone da sequência de codificação (s) da proteína (s) de interesse num vector de expressão, quer isoladamente ou em fusão de tradução de um marcador de epitopo. Uso Os vectores adequados para o sistema de expressão escolhido e processos de biologia molecular convencionais para a clonagem de genes. Para a entrega de genes mediada por Agrobacterium, empregar vetores binários e apresentá-los, utilizando também standaprotocolos rd, em uma cepa de Agrobacterium, como EHA105, para inoculação posterior dos tecidos vegetais.
  3. A escolha de espécies de plantas
    Selecione as espécies de plantas em que a proteína (s) de interesse serão expressas. Note-se que, ao passo que todas as espécies de plantas susceptíveis à transformação genética mediada por Agrobacterium pode ser usado, as nossas espécies de plantas de Nicotiana benthamiana escolha é, que seja facilmente cultivada, altamente susceptíveis a Agrobacterium, e tem grandes folhas que são facilmente inoculados.
  4. O crescimento das plantas
    Crescer uma planta de 4 a 6 semanas em uma panela com Pro-Mix BX em uma panela (20 cm x 20 cm x 20 cm), sob condições controladas-ambiental (por exemplo, câmara de crescimento) de dia longo (ou seja, 16 h de 130 -150 μE m-2 s-1 de luz a 23 ° C e 8 horas e escuro a 20 ° C) e 40-65% de humidade relativa.
    1.5.2 Fertilize ocasionalmente com produtos comercialmente disponíveis por instruções do fabricante. Uma vez que a planta é cultivada, selecionefolhas com o tamanho de 50 mm x 70 mm ou maior (estas medições de comprimento não incluem o pecíolo) para inoculação com Agrobacterium.
  5. A inoculação com Agrobacterium
    Grow Agrobacterium estirpe portadora da construção binário expressando a proteína testada (s) a partir do passo 1.3 durante a noite a 28 ° C em meio YEP (1% de peptona, 1% de extracto de levedura e 0,5% de NaCl) suplementado com os antibióticos apropriados (por exemplo, 100 mg / L de estreptomicina e 10 mg / L, rifampicina para vectores baseados em pPZP-RSC2 24-25).
    1.6.2 Centrifugar as células ressuspensas a OD 600 = 0,5 em tampão de infiltração [10 mM de MgCl 2, 10 mM de MES (pH 5,6), 100 pM de acetosiringona], e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Infiltrar a cultura para o lado abaxial da folha, usando uma agulha de seringa de 1 ml; observar que as folhas são inoculadas in situ, enquanto que está ligado à planta.
    1.6.3 Após a infiltração, cultivar a planta durante 72 h sob o regime de luz de 16 h 130-150 &# 181; E m-2 s-1 de luz a 23 ° C / 8 h escuro a 20 ° C antes da colheita.
  6. Aplicação de inibidores proteossomo
    Para apoiar a noção de que a proteína testada (s) é degradada através de uma via proteosomal, usar inibidores de proteossomo MG132 específicos e lactacistina 28-29, o que deve reduzir ou mesmo bloquear a degradação. Quatro horas antes da colheita (ver passo 2.1), infiltrar as áreas foliares inoculados com Agrobacterium com 10 mM MG132 (EMD Millipore) ou 10 mM lactacistina (Sigma-Aldrich) ou mock-tratar a folha com os respectivos solventes, ou seja, 0,1% de DMSO ou água destilada.

2. Preparação de extractos isentos de células

  1. Colheita Folha
    Colher as áreas inoculadas da folha, geralmente ca. 200-400 mg de peso fresco, e triturá-los em pó fino em nitrogênio líquido. Alternativamente, conta-bater os tecidos, usando qualquer bead-beater (por exemplo, Biospec) ou um amalgamador dental (por exemplo, TPC Avançada Technologies) diretamente no buffer de degradação (ver passo 2.2).
  2. Extração de proteínas
    Preparar um extracto de proteína total, colocando o tecido triturado em 500 mL de tampão de degradação [50 mM Tris-HCL (pH 7,5), 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 5 mM DTT, 5 mM de adenosina-5'-trifosfato, e 1 x inibidor da protease cocktail (Sigma-Aldrich)]. Note-se que a mistura de inibidores de protease afecta principalmente serina, cisteína, aspártico, e metaloproteases e não interfere com a protease 26S. Clarificar o extracto por duas centrifugações sequenciais a 12,000 xg por 5 min.
  3. Reacção de degradação de proteínas
    Transferir volumes iguais de extractos, normalmente 20 mL, para tubos de microcentrífuga e incubar à temperatura ambiente durante períodos de tempo crescente. Tipicamente, o tempo de amostra zero, e 5, 10, 15, 20, e 30 pontos de tempo mínimo. Pare reacções por fervura em tampão de amostra de SDS-gel, e analisá-las por western blotting.
jove_title "> 3. detecção da degradação da proteína por imunotransferência

  1. A electroforese em gel
    3.1.1 resolver as amostras de proteínas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e electrotransferência das proteínas resolvidas para uma membrana de nitrocelulose de acordo com o protocolo padrão 30.
    3.1.2 Determinar a concentração de proteína utilizando o método de Bradford (Bio-Rad), e carregar 50-80 ug de proteína total por pista. Certifique-se de que todas as amostras são carregadas igualmente. Para os controlos de carga, comparar as intensidades de uma espécie de proteína ubíquos, tais como putativo Rubisco grandes correntes que migram como uma banda principal com uma mobilidade electroforética relativa de cerca de 50 kDa, podem ser detectadas em géis corados Coomassie-Blue ou em Ponceau S-ou fluorescente SYPRO Rubi-manchado membranas de nitrocelulose.
  2. Bloqueio
    Bloquear a membrana com 5% de leite desnatado em TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) durante 1 h à temperatura ambiente.
  3. O anticorpo primário
    Diluir anticorpo anti-epitopo primária em 1% de leite desnatado em TBST com a concentração recomendada pelo fabricante e incubar com a membrana bloqueada durante 1 h à temperatura ambiente ou durante uma noite a 4 º C com agitação suave.
  4. Lavagem
    Lavar a membrana é lavada com 20 ml de TBST, durante 15 minutos, uma vez, e duas vezes durante 5 min à temperatura ambiente com agitação suave.
  5. O anticorpo secundário
    Dilui-se anticorpo secundário (por exemplo, anti-IgG de coelho) conjugado com peroxidase de rábano (HRP) em 1% de leite desnatado em TBST tal como recomendado pelo fabricante e incubar com a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave.
  6. Detecção
    Lavar a membrana tal como é descrito no Passo 3.4. Após a lavagem final em TBST, visualizar as proteínas de interesse com um substrato quimioluminescente HRP, mais vulgarmente usando um kit ECL.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A Figura 1, adaptada do Zaltsman et al. 17, ilustra experiências representativas para a detecção da degradação proteosomal em um sistema isento de células. Especificamente, nós demonstramos a desestabilização de uma planta relacionada com a defesa proteína VIP1 pela proteína F-box VBF pela via SCF VBF em N. benthamiana. VBF Arabidopsis e marcadas com HA VIP1 (HA-VIP1 proteínas) foram transientemente co-expressos, e o conteúdo de proteína HA-VIP1 dentro de...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este ensaio baseia-se na expressão das proteínas testadas em tecidos de plantas, assim, o processo de degradação potencial proteosomal obviamente, já ocorre dentro dos tecidos vivos. Nós ensaio desestabilização da proteína, no entanto, apenas nos extratos, com o tempo de amostra de zero servindo como ponto de referência inicial. Por isso, nós definimos como um ensaio isento de células.

Um aspecto importante para o sucesso deste ensaio é a escolha correcta do vector de expressão a partir do q...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Os trabalhos que conduziram a esta publicação tem recebido financiamento do programa Marie Curie COFUND "U-Mobility", co-financiado pela Universidade de Málaga e do Programa da União Europeia 7 º Programa-Quadro (FP7/2007-2013) sob n º 246550 GA. O trabalho em nosso laboratório é suportado por concessões do NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, e BSF para VC

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de ensaio de proteínaBio-Rad500-0001
Coquetel inibidor de proteinase Sigma-AldrichS8820
Sistema Mini-ProteanBio-Rad165-8000
Sistema de eletrotransferência SD de western blotting semi-secoBio-Rad170-3940
Affinity Purified Rabbit Anti-HaICL LabRHGT-45A-Z
Conjugado de peroxidase IgG anti-coelho de cabraThermo Scientific31460
BioTrace, NT membrana de transferência de nitrocelulosePall Corporation27377-000
Substrato HRP quimioluminescente ocidental ImmobilonEMD MilliporeWBKL S0 050
MG132EMD Millipore474790-1MG
LactacistinaSigma-AldrichL6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL SubstratePierce35055

Referências

  1. Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
  2. Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
  3. Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
  4. Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
  5. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
  6. Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
  7. Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
  8. Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
  9. Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
  10. Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
  11. Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
  12. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
  13. Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
  14. Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
  15. Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
  16. Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
  17. Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
  18. Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
  19. Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
  20. Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
  21. Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
  22. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
  23. Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
  24. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  25. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  26. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  27. Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
  28. Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
  29. Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
  30. Current Protocols in Molecular Biology. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).
  31. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: imagej.nih.gov/ij (1997).
  32. Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Interação Patógeno-PlantaSistema Ubiquitina-ProteassomaSubstrato de Proteína F-boxAnálise por Western BlotGel de Poliacrilamida SDSEnsaio de Estabilidade ProteicaInoculação por AgrobacteriumInibidor de Proteassoma MG132
Ensaiando proteosomal Degradação em um sistema de livre-Cell em Plantas
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.