Artigo de método

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

DOI:

10.3791/51294

⸱

10 de junho de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Stemorgan Inc., 3Institute of Advanced Study, Technical University of Munich, 4Institute of Virology, School of Medicine, Wuhan University, 5Department of Molecular and Experimental Medicine, The Scripps Research Institute, 6Research Institute for Biomedical Sciences, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Os métodos descritos neste trabalho mostram como converter uma impressora jato de tinta comercial em um bioprinter com polimerização UV simultânea. A impressora é capaz de construir a estrutura do tecido 3D com células e biomateriais. O estudo demonstrou aqui construiu uma neocartilage 3D.

Resumo

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Bioprinting, que está baseada na impressão a jato de tinta térmica, é um dos mais atraentes tecnologias facilitadoras no campo da engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Com as células de controlo digitais, os suportes, e os factores de crescimento podem ser depositada precisamente a desejada bidimensional (2D) e os locais (3D) tridimensional rapidamente. Portanto, essa tecnologia é uma abordagem ideal para fabricar tecidos que imitam suas estruturas anatômicas nativas. Para o engenheiro da cartilagem com organização nativa zonal, composição da matriz extracelular (MEC), e as propriedades mecânicas, desenvolvemos uma plataforma bioprinting usando uma impressora jato de tinta comercial com fotopolimerização simultânea capaz de engenharia de tecidos de cartilagem 3D. Condrócitos humanos suspensas em poli (etileno glicol) Diacrilato (PEGDA) foram impressos para a construção neocartilage 3D via montagem camada por camada. As células foram fixadas impressos nas suas posições originais depositados, suportado pelo surroFINANCIAMENTO andaime em fotopolimerização simultânea. As propriedades mecânicas do tecido impresso foi semelhante à cartilagem nativa. Em comparação com a fabricação do tecido convencional, a qual requer a exposição de UV mais, a viabilidade das células impressos com fotopolimerização simultânea foi significativamente maior. Neocartilage impresso demonstraram excelente glicosaminoglicanos (GAG) e a produção de colagénio de tipo II, o que era consistente com a expressão do gene. Portanto, esta plataforma é ideal para distribuição célula precisa e arranjo para a engenharia de tecidos anatômico.

Introdução

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Bioprinting baseada na impressão a jato de tinta térmica é uma das mais promissoras tecnologias de base no campo da engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Com controle digital e alto rendimento cabeças fatores células, andaimes e crescimento podem ser precisamente depositado ao desejado bidimensional (2D) e posições (3D) tridimensionais rapidamente. Muitas aplicações de sucesso foram alcançados utilizando esta tecnologia em engenharia de tecidos e medicina regenerativa 1-9. Neste trabalho, uma plataforma bioprinting foi criada com a Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 impressora jato de tinta térmica modificado e um sistema de fotopolimerização simultânea. Hidrogéis sintéticas formuladas a partir de poli (etileno glicol) (PEG) revelaram a capacidade de manter a viabilidade dos condrócitos e promover a produção de ECM condrogénica 10,11. Além disso, a foto-reticulável PEG é altamente solúvel em água, de baixa viscosidade, o que o torna ideal para polímeros usados ​​em simultâneozação durante bioprinting 3D. Neste trabalho, os condrócitos humanos suspensas em poli (etileno) diacrilato glicol (PEGDA; MW 3.400) foram precisamente impresso para construir neocartilage camada por camada, com 1.400 dpi de resolução em 3D. Observou-se distribuição homogênea de células depositadas em um andaime 3D, o que gerou tecido cartilaginoso, com excelentes propriedades mecânicas e produção ECM reforçada. Por contraste, na fabricação manual, as células acumuladas na parte inferior do gel, em vez das suas posições inicialmente depositadas, devido à lenta polimerização andaime, o que levou a formação de cartilagem não homogénea após cultura 2,3.

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Protocolo

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1. Bioprinting Plataforma Estabelecimento

A modificação de impressora foi baseada em uma impressora jato de tinta térmica HP Deskjet 500 e HP 51626A cartucho de tinta preta.

  1. Remova a tampa plástica superior da impressora e cuidadosamente retire o painel de controle a partir da tampa.
  2. Retire os 3 conexões de cabo entre a parte superior da impressora e base. Remova a parte superior da impressora a partir da base.
  3. Na parte superior da impressora, remova o pequeno plástico e acessórios de borracha (sistema de limpeza da cabeça de impressão) no lado direito sob o cartucho de tinta.
  4. Retire a base da bandeja de papel, com molas.
  5. Remova a placa metálica que cobre a barra de alimentação de papel de plástico.
  6. Corte a barra de alimentação de papel de plástico na posição da roda de alimentação meio usando uma serra de mão ou outra ferramenta de corte.
  7. Retire os 2 rodas de alimentação de papel expostos depois da etapa anterior. O plástico roda é muito difícil e um eletrônicoserra será útil.
  8. Limpe a poeira e detritos usando lenços de ar e etanol enlatados.
  9. Prenda a parte superior da impressora para a base.
  10. UV esterilizar a impressora modificada para, pelo menos, 2 horas numa câmara de fluxo laminar antes de usar.
  11. Corte a tampa de um cartucho de tinta HP 51626A usando um serrote ou outra ferramenta de corte.
  12. Esvaziar a tinta e remover o filtro que cobre o poço reservatório inferior da cartilagem.
  13. Lavar o cartucho cuidadosamente, com água corrente.
  14. Ultrasonicate o cartucho no desionizada (DI) de água durante 10 minutos para remover a tinta residual.
  15. Examinar o cartucho para certificar-se que toda a tinta foi removida. Lavar ou pulverizar o cartucho cuidadosamente com etanol a 70% para a esterilização, seguido por água DI esterilizado.
  16. Configurar uma lâmpada ultravioleta de longo comprimento de onda sobre a plataforma de impressão para fornecer capacidade de fotopolimerização simultânea.
  17. Medir a intensidade UV a uma plataforma da impressão utilizando uma luz UVmetros. Ajustar a distância entre a lâmpada de UV e a plataforma de impressora, de modo a intensidade para o objecto de impressão é entre 4-8 mW / cm2 (cerca de 25 cm de distância da lâmpada para a plataforma de impressora).

2. Bioink Preparação

  1. Expansão monocamada de condrócitos
    1. Placa 5.000.000 condrócitos humanos em cada balão de cultura de tecidos T175 por expansão das células em Dulbeccos Modified Eagles Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro de vitela e 1x penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG). As células de cultura a 37 ° C com ar humidificado contendo 5% de CO 2. Altere o meio de cultura a cada 3 dias até que o frasco é de 85% de confluência. Use células da mesma passagem.
  2. Dissolver PEGDA em PBS para uma concentração final de 10% w / v Adicionar fotoiniciador I-2959 a uma concentração final de 0,05% w / v Filtrar esterilizar a solução.
  3. Suspender condrócitos humanos cultivados na solução PEGDA preparado a 5 x 10 6 células /ml.

3. Cartilagem de tecido de impressão

  1. Ligue a impressora e laptop.
  2. Criar um padrão de impressão de um círculo sólido com 4 mm de diâmetro, utilizando o Microsoft Word ou Adobe Photoshop.
    1. Ajuste a posição do padrão e verifique se ele será impresso exatamente no molde plástico.
    2. Calcule o número de cópias necessárias para atingir a espessura desejada de andaime. Para 4 mm de altura, 220 impressões são necessários para criar o andaime desejado.
  3. Carregue o bioink para o cartucho de tinta. Cubra o cartucho com papel alumínio para proteger da exposição UV direto durante a impressão.
  4. Enviar comando de impressão para a impressora. Puxe o sensor de papel quando a impressora começa a imprimir. O processo de impressão de todo deve ter menos do que 4 minutos para um andaime com 4 mm de diâmetro e 4 mm de altura.
  5. Transferência impresso neocartilage para uma placa de 24 cavidades e adicionar 1,5 ml de meio de cultura a cada poço.

4. Viabilidade celular de Avaliação em Scaffold 3D

  1. Incubar a neocartilage impresso no VIVO / solução de trabalho MORTOS viabilidade / citotoxicidade em temperatura ambiente por 15 min no escuro.
  2. Corte o hidrogel célula-laden ao meio e tirar imagens fluorescentes de área de corte.
  3. Contagem vivo (verde) e as células mortas (vermelho) por um observador cego em cinco imagens tiradas aleatoriamente. Calcular a viabilidade celular através da divisão do número de células vivas pelo número total de células vivas e mortas.

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Resultados

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A impressora jato de tinta térmica modificado foi capaz para celular e deposição de andaime no alto rendimento e excelente viabilidade celular. Combinando com fotopolimerização simultânea e biomateriais fotossensíveis, esta tecnologia é capaz de corrigir as células e outras substâncias impressos para os locais inicialmente depositados. De acordo com as propriedades da impressora a jacto de tinta térmica modificada, a resolução de impressão 2D foi 300 dpi com um único volume de gota de tinta de 130 pl. Existem 50 bicos d...

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Discussão

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Este sistema bioprinting 3D com capacidade fotopolimerização simultânea fornece uma resolução de impressão significativamente maior do que o melhor método anteriormente relatado de impressão em in situ de defeitos osteocondrais, utilizando uma seringa extrudido um hidrogel de alginato celular 16. Resolução de impressão mais elevada é particularmente crítica para a engenharia de tecidos de cartilagem para restaurar a cartilagem organização zonal anatómica. Fotopolimerização simultânea durante a montag...

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Divulgações

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Os autores não têm nenhum interesse financeiro neste estudo.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer o apoio do New York Região Capital Alliance Research Grant.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Impressora a jato de tinta térmica HP Deskjet 500Hewlett-PackardC2106aDescontinuada. Comprado recondicionado de fornecedor de internet.
Cartucho de tinta preta HPHewlett-Packard51626a
Lâmpada ultravioletaUVPB-100AP
Medidor de luz UVFerramentas GeraisUV513AB
microscópio de varredura a laser Zeiss LSM 510Carl ZeissLSM 510
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)Mediatech10-013
Penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG)Invitrogen10378-016
Reagente de dissociação celular AccutaseInvitrogenA11105-01
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Invitrogen10010-023
Kit de viabilidade/citotoxicidade vivo/mortoInvitrogenL-3224
Poli(etilenoglicol) diacrilato (PEGDA)Glycosan BiosystemsGS700
Irgacure 2959Ciba Especialidades QuímicasI-2959
Condrócitos articulares humanosLonzaCC-2550

Referências

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  2. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
  3. Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
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