Desenvolvimento de proteínas de fusão biotinylatable tem muitas aplicações potenciais em diversas áreas de pesquisa. Engenharia de proteínas recombinantes é um procedimento para a frente que é eficaz em termos de custos, rendimentos elevados de proteínas personalizados.
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Artigo de método
Expressão, isolamento e purificação do solúveis e insolúveis biotinilados Proteínas de Tecido Nervoso Regeneração
Neste artigo
Resumo
Resumo
Engenharia de proteínas recombinantes utilizou Escherichia coli (E. coli) para sistemas de expressão de quase quatro décadas, e hoje E. coli é ainda o organismo hospedeiro mais utilizado. A flexibilidade do sistema permite a adição de porções tais como uma etiqueta de biotina (para interacção com estreptavidina) e proteínas funcionais maiores, como a proteína fluorescente verde ou proteína vermelho cereja. Além disso, a integração de aminoácidos não naturais como quelantes de iões de metais, grupos funcionais reactivos, exclusivamente sondas espectroscópicas, e as moléculas que conferem modificações pós-traducionais permitiu uma melhor manipulação de propriedades de proteína e funcionalidades. Como resultado desta técnica cria proteínas de fusão personalizáveis que oferecem utilidade significativa para vários campos de pesquisa. Mais especificamente, a sequência da proteína biotinylatable foi incorporado em muitas proteínas alvo, devido à interacção de alta afinidade entre biotina com a avidina e estreptavidina. Esta adição tem ajudado no aumento da detecção e purificação de proteínas marcadas, bem como abrindo o caminho para aplicações secundárias, tais como separação de células. Assim, as moléculas marcadas com biotina mostram uma influência crescente e generalizada nos campos Bioindustrial e biomédicas. Para efeitos de nossa pesquisa, temos projetado proteínas de fusão biotinilado recombinantes contendo fator de crescimento do nervo (NGF) e semaphorin3A (SEMA3A) regiões funcionais. Nós temos descrito anteriormente como estas proteínas de fusão biotinilado, juntamente com outras sequências de proteínas activas, pode ser preso a biomateriais para a engenharia de tecidos e efeitos regenerativos. Este protocolo descreve os conceitos básicos de proteínas biotinylatable engenharia na escala miligrama, utilizando um vetor lac induzível T7 e E. hospedeiros de expressão de E. coli, a partir da transformação de aumento de escala e purificação.
Introdução
Proteínas de cobrir uma vasta gama de biomoléculas que são responsáveis por muitas funções biológicas, levando à formação de tecido adequado e organização. Estas moléculas de milhares de iniciar as vias de sinalização que controlam a regulação positiva e / ou sub-regulação de genes e outras proteínas, mantendo o equilíbrio dentro do corpo humano. O rompimento de uma única proteína afeta toda esta teia de sinais, que podem levar ao aparecimento de distúrbios ou doenças devastadoras. Engenharia proteínas individuais no laboratório oferece uma solução para combater estes efeitos adversos e oferece uma alternativa aos medicamentos de pequenas moléculas. Em 1977, um gen....
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Protocolo
1. Projecção da proteína alvo
- Usando o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) obter uma sequência de aminoácidos para a proteína alvo tendo em conta as espécies de interesse e as variantes de emenda. Seleccionar a sequência de aminoácidos que corresponde à região activa de interesse da proteína.
Nota: Para SEMA3A, aminoácidos 21-747 foram escolhidos. A proteína de fusão foi concebido com NGF, onde a sequência de barstar, aminoácido 1-90, foi adicionado a aminoácidos de NGF 122-241. - Ao N-terminal adicione as seguintes seqüências: 6X-his para a purificação (HHHHHH), Tabaco E....
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Resultados
Clonagem e Expressão de teste
Quando chapeamento é realizado corretamente, único colônias isoladas devem formar a aumentar as chances de arrancar bactérias clonal transformaram células (Figura 2A). No entanto, se demasiadas células são plaqueadas, as placas são incubadas por muito tempo, a 37 ° C ou a transformação é questionável, as colónias podem cobrir a placa de ágar ou de formar agregados maiores de células (Figuras 2B e 2.......
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Discussão
Engenharia de proteínas recombinantes é uma técnica muito poderosa que se estende por muitas disciplinas. É rentável, sintonizável e um procedimento relativamente simples, permitindo a produção de altos rendimentos de proteínas personalizados. É importante notar que a concepção e expressão de proteínas-alvo nem sempre é directa. Expressão basal e estabilidade da proteína recombinante depender de escolhas específicas de vetoriais, E. estirpes de E. coli, células de adições marca peptídica e parâmetros d.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Universidade de Akron para o financiamento que apoiaram este trabalho.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,4-Ditio-DL-treitol, DTT, 99,5% | Chem-Impex International | 127 | 100 g |
| 2-Hidroxietilmercaptano β-Mercaptoetanol | Chem-Impex International | 642 | 250 ml |
| Ácido acético, glacial | EMD | AX0073-9 | 2,5 L |
| Ágar | Bioshop | AGR001.500 | 500 g |
| Sal de ampicilina sódica | Sigma-Aldrich | A9518 | 25 g |
| Antiespumante 204 | Sigma-Aldrich | A6426 | 500 g |
| Barstar-NGF pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µ g | |
| BL21(DE3) Células Competentes | Novagen | 69450 | 1 ml; Expression Host |
| Bradford reagente | Sigma-Aldrich | B6916 | 500 ml |
| BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 ml |
| Filtração em gel padrão | Bio-Rad | 151-1901 | 6 frascos |
| Glicerol | Bioshop | GLY001.1 | 1 L |
| Hidrodiorido de guanidina cloridrato de amioformamidina | Chem-Impex International | 152 | 1 kg |
| Resina Ni-NTA His-Pur | Thermo Scientific | 88222 | 100 ml |
| Ácido clorídrico | EMD | HX0603-3 | 2.5 L |
| Imidazole | Chem-Impex International | 418 | 250 g |
| IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 g |
| Tampão de amostra Laemmli | Bio-Rad | 161-0737 | 30 ml |
| Lauril sulfato de sódio sal, Dodecil de sódio superfície | Chem-Impex International | 270 | 500 g |
| LB Caldo | Sigma-Aldrich | L3022 | 1 kg |
| NovaBlue Células Competentes | Novagen | 69825 | 1 ml; Clonagem de |
| Hospedeiro Fosfato tamponado solução salina | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pacote |
| de Cloreto de Potássio | Chem-Impex International | 01247 | 1 kg |
| Sema3A-pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µ g | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 L |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | 1 kg |
| Hidróxido de sódio | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| Fosfato de sódio diabásico | Sigma-Aldrich | S5136-500G | 500 g |
| Fosfato de sódio monobásico | Sigma-Aldrich | S5011 | 500 g |
| Ótimo caldo | Bioshop | TER409.5 | 5 kg |
| Cloridrato de tetraciclina | Chem-Impex International | 667 | 25 g |
| Tris/Glicina/SDS Tampão, 10x | Bio-Rad | 1610732 | 1 L |
| Base Trizma | Sigma-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Triptona, pancreática | EMD | 1.07213.1000 | 1 kg |
| Extrato de levedura, EMD granulado | 1.03753.0500 | 500 g | |
| Ä KTApurifier10 | GE Healthcare | 28-4062-64 | Inclui kits e acessórios |
| Agitador Orbital de Bancada | Thermo Scientific | SHKE4000 | MAXQ 4000 |
| BirA500 | Avidity | BirA500 | Enzyme vem com tampões de reação e solução de biotina |
| Casette de Diálise | Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer (Força Extra) |
| Tubo de Diálise | Spectrum Laboratories | 132127, 132129 | MWCO: Válvula de desvio de fluxo de 25.000 e 50.000 |
| FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
| Kit de ensaio de quantificação de biotina FluoReporter | Invitrogen | 1094598 | |
| Frac-950 Tube Racks, Rack C | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
| Coletor de frações Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | Inclui kits e acessórios |
| Circulador Aquecido/Refrigerado | VWR | 13271-102 | Modelo 1156D |
| Forno de Aquecimento Série FD | Fichário | Modelo FD 115 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | Descontinuado--Produto de Substituição: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
| J-26 XPI Avanti Centrifuge | Beckman Coulter | 393126 | |
| JA 25.50 Rotor | Beckman Coulter | 363055 | |
| JLA 8.1 Rotor | Beckman Coulter | 969329 | Inclui garrafas de poliporpileno de 1 L |
| JS 5.3 Rotor Beckman | Coulter | 368690 | |
| Capuz de Fluxo Laminar | Themo Scientific | 1849 | Forma 1800 Series Clean Bench |
| Microplate Reader | TECAN | infinite M200 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8004 | 4-gel vertical sistema de eletroforese |
| Mini-PROTEAN TGX Géis Pré-moldados | Bio-Rad | 456-9036 | Qualquer kDa, pente de 15 poços |
| Coluna Ni-NTA | Bio-Rad | 737-2512 | 49 ml Volume ECONO-Column |
| Plasmid Miniprep Kit | Omega Bio-Tek | D6943-01 | |
| PowerPac HC Fonte de Alimentação | Bio-Rad | 164-5052 | 250 V, 3 A, 300 W |
| Tubos de Copolímero de Polipropileno de Fundo Redondo | VWR | 3119-0050 | 50 ml tubos para rotor JA 25.50 |
| Spin-X UF Concentrators | Corning | 431488, 431483 | 20 e 6 ml; MWCO: 10.000 Da |
| Serviço de Subclonagem | GenScript USA Inc. | ||
| Processador Ultrassônico Protein Services | Cole-Parmer | 18910445A | Modelo CV18 |
| Vortex-Genie 2 | Indústrias Científicas | SI-0236 | Modelo G560 |
Referências
- Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
- Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemic....
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Reimpressões e permissões
