Três Culturas dimensionais: Uma ferramenta para o estudo normal Acináceo Arquitetura vs transformação maligna das células de mama

Resumo

Três cultura tridimensional de células epiteliais mamárias de uma membrana basal reconstituída é um método útil para recapitular a arquitectura in vivo da mama benigna, e para diferenciar o fenótipo maligno do fenótipo da mama benigna. Importante, este sistema pode ser aplicado para estudar os carcinomas invasivos em outros tecidos.

Resumo

Carcinomas da mama invasivos são um grupo de tumores epiteliais malignos caracterizada pela invasão de tecidos adjacentes e propensão para metástase. A interação de sinais entre as células cancerosas e seu microambiente exerce uma poderosa influência sobre o crescimento do câncer de mama e comportamento biológico ^1. No entanto, a maioria destes sinais a partir da matriz extracelular são perdidas ou a sua relevância é subinvestigada quando as células são cultivadas em cultura de duas dimensões (2D) como uma monocamada. Nos últimos anos, a cultura tridimensional (3D) com uma membrana basal reconstituída tem surgido como um método de escolha para recapitular a arquitectura dos tecidos de células mamárias benignas e malignas. As células cultivadas em 3D reter as pistas importantes da matriz extracelular e fornecem um sistema ex vivo ^2,3 fisiologicamente relevante. De notar que há cada vez mais evidências sugerindo que as células se comportam de forma diferente quando cultivada em 3D, em comparação com ⁴ 2D. Cultura 3Dpode ser eficazmente utilizada como um meio para diferenciar o fenótipo maligno do fenótipo benigna da mama e para cimentar a sinalização celular e molecular envolvida ^3. Uma das características distintas de células epiteliais benignas é que eles são polarizados de modo a que o citoplasma é apical para o lúmen e o citoplasma basal repousa sobre a membrana basal. Esta polaridade apico-basal é perdida em carcinomas invasivos da mama, que são caracterizadas por desorganização celular e formação da anastomose e ramificação túbulos que esmo infiltrados do estroma circundante. Estas diferenças histopatológicas entre glândula benigna e carcinoma invasivo pode ser reproduzido em ^6,7 3D. Usando os Read-outs apropriadas como a quantificação de estruturas individuais acinares redondos, ou a expressão diferencial de marcadores moleculares validados para a proliferação celular, a polaridade e a apoptose, em combinação com outras técnicas de biologia molecular e celular, cultur 3De pode fornecer uma ferramenta importante para compreender melhor as alterações celulares durante a transformação maligna e para delinear a sinalização responsável.

Introdução

Cultura tridimensional (3D) de células epiteliais de mama na membrana basal reconstituída é um importante sistema modelo para estudar o fenótipo complexo e sinalização associada da mama normal e câncer de mama ^2,3. A unidade funcional de mama lobular é a unidade terminal de conduta (TDLU) que consiste de uma pequena conduta que se ramifica em ácinos. Os ácinos são estruturas altamente organizadas, compostas por duas camadas de células, células epiteliais e mioepiteliais, que estão rodeados por uma membrana basal ^5. As características mais distintivas de ácinos normais são polarização celular, o apego à membrana basal subjacente e contatos célula....

Protocolo

1. Preparação de Materiais e Meios de Cultura

1. Fator de crescimento Thaw reduzida (TFG) Matrigel a 4 ° CO / N.
2. Aqueça mídia completas para linha celular necessário a 37 ° C. MCF10A-ATCC especificado media; Meio F-12 de Ham-HME suplementado com 5% de soro fetal bovino, ml, 5 ug / ml de insulina, factor de 1 ug / hidrocortisona de 10 ng / mL de crescimento epidérmico, e 100 ng de toxina da cólera ml /; F-12 media de SUM149-Ham suplementado com FBS a 5%, 2 ug / ml de hidrocortisona e de 5 ug / ml de insulina; e MDA-MB-231-10% de FBS-DMEM
3. Precool um slide de câmara de 8 poços no gelo.
4. Prepare cultura de tecidos capô e suprimentos. ....

Resultados

Cultura 3D pode ser efetivamente usado para diferenciar fenótipo maligno das células epiteliais mamárias humanas do peito benigno. Células benignas Solteiro banhado em Matrigel crescer como estruturas esféricas organizados, que podem facilmente ser fotografada como único ácinos plana rodada em um avião usando imagens de contraste de fase. As células malignas único banhado em Matrigel crescer de forma anárquica, mostrar muito elevado índice de refração e são difíceis de imagem em um plano. Como mostrado na Figura.......

Discussão

Nós descrevemos aqui a cultura tridimensional de células epiteliais mamárias de uma membrana basal reconstituída e a utilidade deste sistema para diferenciar entre versus maligna fenótipo benigna da mama. Este sistema também pode ser utilizado para cultura de diferentes tipos de células de outros tecidos glandulares e tem sido relatada como tendo sido utilizados com sucesso para a cultura epitelial da próstata, do epitélio brônquico, e as células epiteliais da tiróide, para citar alguns ^12-14. A importância d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fator de Crescimento Reduzido Matrigel	BD Biosciences	354230	Evite repetir, congelar, descongelar
Escorregadores de hamber de vidro Lab-Tek 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Pré-resfriado em gelo
Corrediças de câmara de vidro Lab-Tek 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Pré-resfriado em gelo
Cabra anti rato F (ab ´)2 fragmento	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Soro de cabra normal	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Sondas moleculares		de anticorpos Alexa conjugados fluorescentes	Por favor, olhe para o site de sondas moleculares
Prolongue o reagente antifade de ouro com a	sondas moleculares	P36935
Kit de colheita	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	diluição 1:100 para IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	diluição 1:100 para IF
Anti-fosfo-histona 3 (Ser10)FITC Conjugado	Fisher Scientific	16-222	diluição 1:100 para IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Sinalização	9661s	diluição 1:50 para IF
Anti-E-caderina	BD Biosciences	610181	diluição 1:200 para IF

célula de cultura 3D das DAPI