Artigo de método

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

DOI:

10.3791/51341

⸱

11 de junho de 2014

 ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Department of Oncology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Lawson Health Research Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo proporciona metodologias detalhadas para a utilização de ensaios tridimensionais (3D), para quantificar a invasão das células do cancro da mama. Especificamente, vamos discutir os procedimentos necessários para a criação de tais ensaios, quantificação e análise de dados, bem como métodos para analisar a perda da integridade da membrana que ocorre quando as células invadem.

Resumo

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É agora bem conhecido que o microambiente celular e do tecido são reguladores críticos que influenciam a iniciação e progressão tumoral. Além disso, a matriz extracelular (ECM) tem sido demonstrado ser um regulador crítico do comportamento das células em cultura e na homeostase in vivo. A abordagem actual de cultura de células em duas dimensões (2D), superfícies de plástico resulta na perturbação e perda de interacções complexas entre as células e o seu microambiente. Através do uso de três dimensões (3D) de ensaios de cultura, são estabelecidas as condições para a interacção célula-microambiente que se assemelha ao microambiente in vivo. Este artigo fornece uma metodologia detalhada para cultivar células de câncer de mama em uma matriz de proteínas de membrana basal 3D, exemplificando o potencial da cultura 3D na avaliação da invasão celular no ambiente circundante. Além disso, iremos discutir como estes ensaios 3D tem o potencial para analisar a perda de sinalização Molecules que regulam a morfologia epitelial por imunomarcação procedimentos. Estes estudos ajudar a identificar detalhes importantes mecanicistas nos processos que regulam a invasão, necessários para a propagação do câncer de mama.

Introdução

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Migração e invasão de células individuais ou coletivas são duas características de câncer, e necessário para a propagação metastática de células de câncer 1-4. A capacidade de células cancerígenas para iniciar metástase depende da sua capacidade para migrar e invadem o tecido vizinho usando invadopodia para degradar a membrana basal das células. Invadopodia são saliências de degradação da matriz dinâmica ricas em actina que permitem a degradação da matriz extracelular através da liberação de proteases que degradam a matriz 5. Invasão de células do cancro envolve a degradação da matriz seguindo-se a migração das células cancerosas e isto é acompanhado de uma reorganização do ambiente da matriz tridimensional (3D) 2. Assim, para penetrar através da matriz, uma célula deve transformar a sua forma e interagir com a matriz extracelular (ECM) 2.

A manutenção da integridade do tecido mamário depende fortemente controlled arquitectura dos tecidos, uma vez junções célula-ECM e de adesão célula-célula influenciar a expressão genética e a interrupção da polaridade epitelial pode levar ao aparecimento de cancro 6-10. No entanto, a maioria dos in vitro de migração e invasão ensaios como transwell ensaios de câmara ou ensaios ferida-risco são bidimensionais (2D) e, portanto, estes negligenciar as interações complexas entre as células e seu meio ambiente adjacente 3,6,8,11-14. Diversidades morfológicas e funcionais consideráveis, incluindo variações na morfologia celular, diferenciação celular, adesões célula-matriz e os padrões de expressão gênica foram detectados através da cultura de células em culturas 3D que são comumente faltando em 2D ensaia 2,6,8,11. Assim, a utilização de testes de 3D ​​são significativamente benéfico em recapitulando a mais fisiológica em condições in vivo, levando a uma melhor tradução das descobertas revolucionárias em pesquisa básica para a clínica 6-10. No entanto, deve-se notar, Apesar das muitas vantagens obtidas com a utilização de culturas em 3D, este modelo não pode capturar todas as complexidades do microambiente do tumor in vivo, que inclui vários tipos de células. No entanto, é possível incorporar células estromais em modelos 3D (por exemplo, os fibroblastos, leucócitos e macrófagos) para estudar o efeito da interação tumor-estroma na adesão célula cancerosa e invasão 15-17.

Células epiteliais de mama em cultura crescer de forma mais eficaz quando as proteínas da MEC, como laminina e colágeno estão presentes. Com esta conhecida, uma mistura de matriz comercialmente disponível foi derivado de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) de tumor murino e é conhecido como matriz da membrana basal 2,8 Matrigel. Um número de técnicas têm sido estabelecido para cultivar células epiteliais como colónias em 3D da matriz da membrana basal 2,8. O modelo da matriz da membrana basal 3D é eficaz para o estabelecimento de células da mama, tanto malignas e não malignascrescimento, assemelhando-se o que está ocorrendo no ambiente in vivo 18,19. MCF10A células são células epiteliais mamarias não malignas. Quando crescido na matriz da membrana basal, estas células apresentam características de in vivo de células da mama normais e submetidos a proliferação celular, a polarização celular, apoptose e para estabelecer o espaço lúmen 8,12,20 controlada. Além disso, a aparência de núcleos de células de células que formam MCF10A ácinos em culturas 3D mais se assemelham aos de células epiteliais mamárias de tecido do que os cultivados em monocamada de 21. Estudos por Bissell e colegas foram os primeiros a mostrar que as células malignas da mama podem ser diferenciadas a partir de células não-malignas da mama, quando cultivada em um ambiente rico em laminina, uma vez que as células apresentam um fenótipo maligno altamente desorganizada, a proliferação aumentada, diminuída da célula-a- a adesão celular, o aumento da expressão de marcadores mesenquimais e um aumento no número de estrutura invasiva formado 3,6,22.

Anormalidades do ambiente celular pode influenciar a formação do tumor 20. O método de cultura em 3D podem ser utilizados para estudar a eficácia de comunicação que ocorre entre as células tumorais e o seu ambiente envolvente e determinar a expressão de proteínas tais influências 14,20,21,23 comunicação. Este artigo estabelece uma metodologia detalhada para crescer MDA-MB-231 de cancro da mama em culturas em 3D para analisar invasão e para estudar a perda de morfologia epitelial utilizando um marcador epitelial laminina, um componente da membrana basal de células 18,19,24, 25. Os procedimentos detalhados fornecem a capacidade de quantificar com precisão e de forma reprodutível estreladas (invasiva) de formação da estrutura por qualquer célula de cancro invasivo e não se limitando a linhas celulares de cancro da mama (comum, tais como MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, ou T47D ). Assim, este ensaio pode servir como uma plataforma para avaliação da forma como a expressão da proteína em células ou tratamento com pro-ou anti-compostos invasivos regulam a degradação da matriz extracelular, pelas células únicas ou múltiplas.

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Protocolo

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1. Cultura tridimensional de células de câncer de mama em Membrana Basal Matrix (A Técnica Embedment)

  1. Manuseio matriz membrana basal Matrigel: Descongele no gelo durante a noite a 4 ° C. Matriz da membrana basal é líquido a baixa temperatura mas solidifica à temperatura ambiente. Mantenha a matriz da membrana basal em gelo (Figuras 1A-B).
  2. Cobrir a No.1 prato confocal com fundo de vidro com 50 ul de matriz da membrana basal por meio de difusão da matriz, utilizando a ponta de uma P-200 Pipetman num padrão em espiral (Figura 1C). Tenha cuidado ao espalhar a matriz da membrana basal para evitar a formação de bolhas de ar. Da mesma forma, evitar a propagação da matriz para fechar as fronteiras do prato fundo de vidro para evitar a formação de menisco. Se a matriz de membrana basal manuseamento inexperiente, em seguida, pré-arrefecido a louça, P-200 Pipetman e pipetas pode ser em gelo (em alternativa, deixado durante a noite num frigorífico a 4 ° C). Este passo ofertastempo adicional para espalhar a matriz da membrana basal antes de solidificação. Colocar a cápsula (s) numa incubadora de cultura de células (a 37 ° C com 5% de CO 2) durante pelo menos 30 minutos para permitir que a matriz da membrana basal para solidificar (Figura 1D).
  3. Enquanto a matriz é submetido a solidificação, trypsinize confluente de 100 mm de placa de células de 70-80%. Uma vez que as células tenham começado a levantar para fora da placa, ressuspender-los em 10 ml de meio RPMI 1640 contendo 10% (v / v) de soro fetal bovino (FBS), para inactivar a tripsina (Figura 1E). Em seguida, transferir as células ressuspensas para um tubo cónico de 15 ml (Figura 1F).
  4. Rodar as células (presente no tubo cónico) a 100 xg durante 3 minutos em uma centrífuga de cultura celular dedicado (Figuras 1G-H).
  5. Enquanto as células estão a ser girado para baixo, alíquota de 50 ul de matriz para um tubo de microcentrífuga de 1 ml (nota: cada prato de vidro de fundo é atribuído um tubo de microcentrífuga, portanto, sea experiência requer três pratos, então segue-se que três tubos de microcentrífuga também são necessários), e, em seguida, colocar o tubo em gelo (Figura 1B).
  6. Aspirar o meio do tubo cónico da etapa 1.4, mas deixando a pelota não perturbadas (Figura 1I). Suspenda as células (que foram giradas para baixo) em 1 ml de meio RPMI suplementado com FBS (Figura 1J).
  7. Uma vez que as células são contadas utilizando um hemocitómetro (Figura 1K), ou um contador de partículas alíquota de células de 2,5 x 10 4 células para dentro do tubo de microcentrífuga e ainda por cima utilizando os meios adequados, de modo a obter um volume total de 50 ul (Figura 1D).
  8. Misturar as células do passo 1.7 (25.000 células em 50 mL) com o tubo de microcentrífuga contendo matriz a partir do passo 1.5, em uma proporção de 1:1; o volume final será de 100 ul (Figura 1M).
  9. Suavemente prato 100 ul da matriz: mistura de células a partir do passo 1.8 para a solidified membrana basal revestida de matriz prato a partir do passo 1.2 (Figura 1 N). Isto permite a células a ser incorporado na matriz de membrana basal.
  10. Colocar a cápsula (s) para a incubadora de cultura de células (a 37 ° C com 5% de CO 2) e permitir que a matriz de: mistura de células para solidificar, pelo menos, 30 min.
  11. Uma vez que a matriz: mistura de células é solidificado, adicionar 2 ml de meio RPMI suplementado com FBS para o prato (Figura 1O) e levar o prato de volta na incubadora onde vai ser armazenado para o resto da experiência (Figura 1P).
  12. Mudar mídia todos os dias durante um período de 5 dias (ou conforme exigido para um ensaio, da duração do ensaio para MDA-MB-231 é de 5 dias de duração).
  13. Usando um microscópio de luz, tomar contraste de interferência diferencial (DIC) imagens dos MDA-MB-231 colónias em suspensão na matriz da membrana basal (Figura 3A). Imagem 20 áreas representativas a 10X objetivo uma vez por diadurante cinco dias, para determinar a colónia morfogénese (Figura 3C).
  14. Analisar imagens cegamente para determinar a formação de colónias de células estreladas (Figura 3B). Uma colónia é considerada estreladas se uma ou mais projecções de esferóide das células são percebidos. Para determinar o percentual de colônias estreladas invasivos, divida o número de colônias estreladas pelo número total de colônias de células por imagem adquirida, e, em seguida, a média das colônias estreladas percentagens dos 20 imagens para cada dia.

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Figura 1. Cultura tridimensional de MDA-MB-231 de cancro da mama na matriz da membrana basal (a técnica de acamamento). AB) Um esquema da montagem experimental (realizada na coifa). C) O bem do prato fundo de vidro revestidocom 50 ul de matriz de membrana basal D) do prato. (es) colocado numa incubadora de cultura de células (a 37 ° C com 5% de CO 2) para permitir que a matriz para solidificar, pelo menos, 30 min.) E As células foram tratadas com tripsina. F ) As células foram ressuspensas em um tubo de 15 ml. GH) (presente em células tubo cónico) foram centrifugadas a 100 xg durante 3 minutos em uma centrífuga de cultura de tecidos. I) da pelota celular. J) As células (que foram fiados para baixo) foram ressuspensas em 1 ml de meio RPMI suplementado com FBS. K) As células foram contadas utilizando um hemocitómetro. G) 2.5 x 10 4 alíquotas de células no tubo de microcentrífuga e com tampo utilizando os meios adequados, de modo a obter um volume total de 50 ul. M ) Misturar as células do passo 1.7 (25.000 células em 50 mL) com o tubo de microcentrífuga contendo matriz a partir do passo 1.5, em uma proporção de 1:1; o volume final será de 100 μ.; L N) Gently placa de 100 mL da matriz: mistura de células a partir do passo 8 para o prato revestido de matriz solidificada a partir do passo 1.2 O) Uma vez que a matriz: mistura de células é solidificado, adicionar 2 ml de meio RPMI suplementado com FBS a. o prato. P) Coloque o recipiente na incubadora, onde serão armazenados para o resto da experiência.

2. Exame de Características morfogênicas de culturas 3D com Imunofluorescência

  1. Configurar uma bandeja de gelo, fosfato frio solução tamponada (PBS), 20% de acetona: 80% de metanol (a solução fixadora) e 3% de albumina de soro bovino (BSA; solução de bloqueio) (Figura 2A) para retirar a cápsula (es) da incubadora.
  2. Colocar a cápsula (s) no suporte de tabuleiro de gelo e aspirado, em seguida, lavar 3x com 2 ml de PBS frio (Figura 2B).
  3. Depois da última lavagem de PBS é aspirado, adicionar 2 ml de 20% de acetona: solução de metanol a 80% para o prato (s) (Figura 2C (Figura 2D).
  4. Uma vez que a 20 min de fixação é terminada, os pratos trazer de volta à temperatura ambiente, aspirar o fixador, e, subsequentemente, lavar 3x com PBS. Uma vez que a última lavagem de PBS é aspirado, adicionar 2 ml de BSA a 3% para o prato (s) para bloquear durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente (Figura 2E).
  5. Durante o período de bloqueio preparar diluições de primário (laminina V 1:100) e anticorpos secundários (a uma diluição adequada) dissolvidos em 3% de albumina sérica bovina (BSA), um tampão de bloqueio. Por favor, note que a 400-500 mL da solução "BSA + anticorpo primário 'deve ser adicionado diretamente na matriz: mistura de células.
  6. Uma vez a 30 minutos de bloqueio ter expirado, adicionar os anticorpos primários e incubar durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente (Figura 2F). Por favor, note que não lavagens PBS deve ser realizada após a 30 min blockinperíodo g.
  7. Após a conclusão do passo 2.6, remover a solução de BSA + anticorpo primário ", e lavar 3x com PBS.
  8. Adicionar o anticorpo secundário dissolvido em BSA a 3% (a uma diluição adequada) directamente sobre a matriz de: mistura de células, cobrir os pratos e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente (Figura 2G).
  9. Remover a solução de BSA + anticorpo secundário ", e lavar 3x com PBS.
  10. Adicionar 2 ml de Hoechst 33258 (1:10.000) dissolvidos em PBS para a coloração de núcleos, e incubar durante 5 minutos, sob uma folha de alumínio (ou cobrir com um recipiente opaco para limitar a fotodegradação) (Figura 2H).
  11. Uma vez que a 5 min de incubação com Hoechst 33258t ter expirado, lave o prato (s) de 5x com PBS.
  12. Adicionar meio de montagem diretamente na matriz: mistura de células no prato confocal e cobrir com lamela de vidro com cuidado para evitar induzir quaisquer interrupções para a integridade das colônias no matri membrana basalx: mistura de células (Figura 2I).
  13. Colocar a placa (s) para secar durante a noite (ou 24 horas) à temperatura ambiente (Figura 2I). Depois de seco, o prato (s) pode ser armazenada a -20 ° C, mas é altamente recomendado que eles devem ser trabalhada, tão rapidamente quanto possível.
  14. Adquirir imagens utilizando um microscópio de fluorescência com comprimentos de onda de laser adequados de anticorpos utilizados (Figuras 3D-E).

figure-protocol-2
Figura 2. Exame de culturas em 3D, por imunofluorescência. . A) Um esquema do arranjo experimental B) Dish (es) colocado na bandeja de gelo e mídia aspirado; subsequentemente, as células foram lavadas três vezes com 2 ml de PBS frio C) 2 mL de acetona a 20%:. solução de metanol a 80% adicionado no prato (s) D) para corrigir as células.20 min a 4 ° C (ou em gelo ou num refrigerador). E) 2 ml de BSA a 3% adicionado ao prato (s) para bloquear durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. F) Uma vez que a 30 min de bloqueio ter expirado, adicionar os anticorpos primários e incubar durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente G) os anticorpos secundários dissolvidas em BSA a 3% (a uma diluição adequada) foram adicionadas directamente sobre a matriz de membrana basal:. mistura de células; . subsequentemente pratos coberta e incubada durante 1 hr à temperatura ambiente H) 2 ml de Hoechst (1:10.000; dissolvida em PBS) adicionado ao dishe (es) e as células incubadas durante 5 minutos sob uma folha de alumínio I) meio de montagem adicionado directamente. sobre a matriz: mistura de células no prato confocal e o prato é coberta com lamela de vidro. Prato (s) deixa-se secar durante a noite (ou 24 horas) à temperatura ambiente.

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Resultados

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Um exemplo de MDA-MB-231 em células invasoras matriz 3D é ilustrada na Figura 3C. As células são incorporados na matriz (Dia 1) e começam a formar-(estreladas) estruturas invasoras no Dia 3, e invadir completamente para dentro da matriz por Dia 5 (Figura 3C). O número de colónias formadas estreladas são contadas, e expressas como uma percentagem do número total de colónias por placa (invasivos e não invasivos). Além disso, uma vez que as medições são feitas diariamente durante cinco dia...

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Discussão

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O desenvolvimento das técnicas de cultura de células em 3D tem permitido aos investigadores estudar a transformação de células epiteliais da mama, o que nos permite visualizar as alterações morfológicas drásticas. Além de analisar a invasão da célula, os esferóides epiteliais mamárias simples ou multicelulares pode ser utilizado para avaliar alterações na adesão celular, a proliferação, tamanho, polaridade e basal-apical. Em contraste com os métodos previamente descritos, onde as células são cobertas com 8 EC...

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Divulgações

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Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi conduzido com fundos para MB, do Canadian Institutes of Health Research (CIHR), bolsa MOP 107972. MB, recebeu um Prêmio de Salário de Novo Investigador do CIHR. DC recebeu bolsas de estudo da Unidade Translacional de Pesquisa do Câncer de Mama e do Programa de Treinamento Estratégico do CIHR em Pesquisa do Câncer e Transferência de Tecnologia, Programa Regional de Câncer de Londres. CG é beneficiário de bolsas de estudo da Unidade Translacional de Pesquisa do Câncer de Mama, Programa Regional de Câncer de Londres e do CIHR- Programa de Treinamento Estratégico em Pesquisa e Transferência de Tecnologia do Câncer. Sgd.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de 1,5 mlVWRCA10011-700estéril e descartável
de 100 mm BD353003VWRCABD353003estéril e descartável
de 15 mlVWRCA21008-918estéreis e descartáveis
de 1 mlVWR10011-350Estéril, descartável
200 μ l ponteiras filtradasVWR22234-016Estéril, descartável
20 μ l pontas filtradasVWR22234-008estéreis, descartáveis
35 mm com fundo de vidro MatTek CorporationP35G-1.0-14-CPré-resfriado antes do uso
Albumina de soro bovino (BSA)BioShopALB003.100Usado a 3% para IF
Alexa Fluor 488 Anti-Mouse IgG (H+L) de cabra, altamente adsorvidoLife Technologies  A110291:250 para IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife Technologies  A110111:1,200 para IF
Anti-Beta-Catenina Laboratórios de Transdução BD610153Monoclonal de camundongo; Usado a 1:100 para
IF Soro fetal bovino (FBS)SigmaF1051Usado a 10% (v/v) 
Hoechst 33258, Pentahidrato (bis-benzimida) - 10 mg⁄ ml Solução em WaterLife TechnologiesH3569Usado a 0,1% (diluição 1:10,000)
InVivo Analyzer Suite Media CyberneticsUsado para imagens de cultura 3D (imagens DIC em 10X e 40X)
Kisspeptin-10 (KP-10)EZ BiolabsPT0512100601Usado em 100 nM 
Anti-LamininaCedarlaneAB19012 (CH)Coelho-policlonal humano de corpo inteiro; Usado a 1:100 para
microscópio de varredura a laser IF LSM-510 META ZeissUsado em objetiva de 63X; lente de imersão em óleo
Matrigel fenol vermelho livre (BD356237)VWRCACB356237  Lote nº 2180819; Microscópio Olympus IX-81 de 10,4 mg/ml
 OlympusUsado para imagens de cultura 3D (imagens DIC a 10X e 40X)
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)Life Technologies15140-122Antibiótico (adicionado ao meio; usado a 0,01%)
Pipeta de 10 mlVWRCA53300-523estéril e descartável
com glutaminaLife Technologies11875-119Usado para cultura de células
MDA-MB-2310,25% de tripsina-EDTA (1x), vermelho de fenolLife Technologies25200-072Usado para tripsinizar células MDA-MB-231
MEGM (kit de bala): MEBM (CC3151) + Cotas únicas (CC4136)LonzaCC-3150Usado para cultura de células MCF10A
Placa de cultura Tubo Falcon Pontas filtradas Pratos de cultura Confocal No.1 de Meio RPMI 1640

Referências

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3D Invasion AssayBreast Cancer CellsBasement Membrane MatrixLight MicroscopyImmunofluorescent MicroscopyStellate Colony FormationMDA MB 231 CellsECM Protein LocalizationCell Culture IncubatorFluorescent Antibody Staining

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