Captura de glicopeptídeos de Superfície Celular Proteômica

Resumo

As proteínas de superfície são biologicamente importantes e amplamente glicosilada. Apresentamos aqui uma abordagem de captura de glycopeptide para solubilizar, enriquecer e deglycosylate estas proteínas para análise proteômica baseada LC-MS fáceis.

Resumo

Proteínas de superfície celular, incluindo as proteínas da matriz extracelular, participam em todos os principais processos e funções celulares, tais como o crescimento, a diferenciação e proliferação. A caracterização detalhada destas proteínas fornece informações ricas para a descoberta de biomarcadores, a identificação do tipo de célula, e seleção-alvo da droga, bem como ajudando a avançar a nossa compreensão da biologia celular e fisiologia. Proteínas de superfície, no entanto, colocam desafios analíticos significativos, devido à sua inerente baixa abundância, alta hidrofobicidade, e pesadas modificações pós-traducionais. Aproveitando a glicosilação em proteínas de superfície predominante, apresentamos aqui uma abordagem de captura de glicopéptido de alto rendimento, que integra as vantagens de vários meios N-glycoproteomics existentes. Nosso método pode enriquecer os glicopeptídeos derivados de proteínas de superfície e remover seus glicanos para proteômica fáceis utilizando LC-MS. A N-glycoproteome resolvido compreende a informação de identidade e quantidade de proteína, bem como os seus locais de glicosilação. Este método foi aplicado a uma série de estudos em diversas áreas, incluindo o cancro, as células estaminais, e a toxicidade da droga. A limitação do método reside na fraca abundância de proteínas de membrana de superfície, de tal modo que uma quantidade relativamente grande de amostras é necessária para esta análise em comparação com estudos centrados em proteínas citosólicas.

Introdução

Proteínas da superfície da célula interagir com o ambiente extracelular e transmitir sinais a partir do exterior para o interior de uma célula. Assim, estas proteínas, incluindo proteínas de matriz extracelular, desempenham papéis críticos em todos os aspectos da biologia celular e fisiologia variando de proliferação, o crescimento, a migração, a diferenciação de envelhecimento e assim por diante. Proteínas de superfície de funcionar interagindo com outras células, proteínas e pequenas moléculas ^1-3. Caracterização molecular de proteínas da superfície celular, é de grande interesse, não só para os biólogos, mas também para as empresas farmacêuticas, mais d....

Protocolo

1. Colheita Membranas

1. Adicionar tampão hipotónico (10 mM Tris-HCl, 10 mM de KCl, 1,5 mM MgCl _2, pH 8,0) com o cocktail inibidor de protease para um agregado de células (~ 10 ⁸ células) e incuba-se durante 15-30 minutos em gelo. Lyse as células por fazer passar a amostra através de agulhas de seringas (5-10 passagens) ou homogeneizar a amostra por um homogeneizador Dounce (15-30 AVC). Use um hemocitômetro e coloração azul de tripan para verificar a eficiência da lise.
2. Obter a fracção microssomal por uma centrifugação diferencial do ligado em 3000 gx 15 min e em seguida a 100.000 gx 2 hr. A primeira centrifugação obtém uma pel....

Resultados

Uma carta do procedimento experimental fluxo representativo é resumido na Figura 1. A rotulagem e as novas medidas de fracionamento são opcionais e os detalhes estão descritos em uma publicação recente ^18. Uma outra opção é para analisar os péptidos não modificados, que não reagem com a resina. As vantagens da análise dos péptidos não modificados incluem a identificação potencial de peptídeos e proteínas não glicosiladas, tais como claudinas nas junções apertadas; uma vantagem adicional é a q.......

Discussão

Aqui apresentamos uma estratégia de captura de glycopeptide para perfilar as proteínas da superfície celular. O método pode ser aplicado para estudar as proteínas segregadas, tal como aqueles em sangue, assim como em outros fluidos corporais, ou em meios de cultura de células.

O sucesso do método que se baseia na digestão completa de amostras; por conseguinte, uma caracterização de SDS-PAGE da eficiência da digestão é necessário, especialmente para a análise pela primeira vez de uma amostra........

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamida	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Periodato de sódio	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz gel hidrazida	Bio-Rad	153-6047
Tripsina	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak Cartucho C-18	Waters	WAT054955
Oasis MCX Waters		186000252
Inibidor de protease coctail	Sigma	P8340
Ureia	Amersco	568
Sulfito de sódio	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
α-1 tripsina	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumina	Sigma	A5503
Conalbumina	Sigma	C0755