Métodos para facilitar o crescimento microbiano em fluxos de resíduos de fábricas de celulose e caracterização do potencial de biodegradação de micróbios cultivados

Resumo

Os resíduos industriais podem ser coletados e modificados para analisar o crescimento microbiano. As técnicas de extração de lignocelulose fornecem componentes para analisar a capacidade específica de biodegradação. A cromatografia gasosa-espectrometria de massa identifica produtos de fermentação de microrganismos cultivados em resíduos de polpa. Esses métodos determinam a capacidade metabólica dos microrganismos de degradar os resíduos de polpa.

Resumo

O processo kraft é aplicado a lascas de madeira para separação de lignina dos polissacarídeos dentro da lignocelulose para celulose que produzirá um papel de alta qualidade. O licor negro é um resíduo de polpação gerado pelo processo kraft que tem potencial para bioconversão a jusante. No entanto, a natureza recalcitrante dos recursos de lignocelulose, seus derivados químicos que constituem a maior parte do carbono orgânico disponível no licor negro e seu pH básico apresentam desafios para a biodegradação microbiana desse resíduo. Os métodos de coleta e modificação do licor negro para o crescimento microbiano visam a utilização desse resíduo de celulose para converter a lignina, os ácidos orgânicos e os subprodutos da degradação de polissacarídeos em produtos químicos valiosos. As técnicas de extração de lignocelulose apresentadas fornecem um método reprodutível para a preparação de substratos de crescimento de lignocelulose para a compreensão das capacidades metabólicas de microrganismos cultivados. O uso de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas permite a identificação e quantificação dos produtos de fermentação resultantes do crescimento de microrganismos nos resíduos de polpa. Esses métodos, quando usados em conjunto, podem facilitar a determinação da atividade metabólica de microrganismos com potencial para produzir produtos de fermentação que agregariam maior valor ao sistema de polpação e reduziriam o desperdício de efluentes, aumentando assim os lucros potenciais da moagem de papel e oferecendo usos adicionais para o licor negro.

Introdução

A polpação de madeira é um processo quimicamente intensivo que foi otimizado ao longo de muitos anos para criar um sistema com o mínimo de desperdício. No entanto, alguns resultados desse processo podem ser usados para produzir produtos de maior valor. O licor negro é um exemplo. É gerado a partir do processo kraft, que é o método de polpação química dominante, representando 85% da produção mundial de lignina¹. O processo kraft (Figura 1) utiliza temperatura (160-200 °C), pressão (120 psig) e os produtos químicos contidos no licor branco (hidróxido de sódio e sulfeto de sódio) para dissolver a lignina das fibras de madeira^2,3. O licor negro contém lignina, ácidos orgânicos e subprodutos de degradação de polissacarídeos⁴. É incinerado para produzir vapor e recuperar produtos químicos na caldeira de recuperação que fornece energia térmica para os processos de fabricação e polpação de papel a jusante. O volume de licor negro gerado pela polpação pode exceder a quantidade que a caldeira de recuperação pode processar efetivamente. Descartar o licor negro como efluente afeta negativamente a flora e a fauna aquáticas e, portanto, não é uma opção. A aplicação de organismos microbianos que poderiam usar licor negro para crescimento seria benéfica em termos de aumento da recuperação química e geração de produto(s) de valor agregado que melhoraria a análise geral do ciclo de vida do sistema de polpação. A conversão química e biológica de monômeros derivados de lignina produziu com sucesso vanilina e ácido cinâmico para uso como adoçantes alimentares e aditivos de fragrâncias, fenol usado para plásticos e resinas e ciclohexano, que poderia ser usado como combustível⁵.

Trabalhos anteriores sobre biodegradação desse resíduo de celulose foram focados na despolimerização de lignina. O Instituto Internacional de Lignina (ILI) relata que entre 40 e 50 milhões de toneladas de lignina são produzidas a cada ano (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Apenas 1,5% dessa lignina é usada para processos industriais comerciais⁶. A despolimerização da lignina pelas enzimas lacase e peroxidase produzidas por fungos da podridão branca dos gêneros Phanerochaete e Trametes tem sido estudada longamente⁷. Bactérias do solo conhecidas por degradar compostos aromáticos como Nocardia e Rhodococcus⁸, Pseudomonas putida mt-2⁹ e Streptomyces viridosporus T7A¹⁰ também demonstraram ser capazes de degradação da lignina. A degradação bacteriana dos resíduos de polpação é promissora porque algumas bactérias podem prosperar nas condições salinas e alcalinas (pH 10-14) que caracterizam os efluentes de resíduos de polpação¹¹. Embora a lignina seja o principal componente do licor negro, os microrganismos também podem degradar os outros componentes que compõem o licor negro. Essas técnicas não identificam exclusivamente microrganismos degradadores de lignina, mas servem para identificar microrganismos que podem ser aplicados diretamente no licor negro residual de polpação, em vez de seus constituintes processados.

O licor preto foi coletado e modificado para crescimento microbiano por meio de neutralização e esterilização por filtro. Os requisitos de crescimento microbiano foram identificados para um isolado microbiano ambiental por experimentos de crescimento mínimo de meio em componentes lignocelulósicos produzidos por um novo protocolo de extração de lignocelulose. Os meios de crescimento foram analisados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) para determinar os produtos metabólicos do isolado microbiano ambiental quando cultivado em licor negro como única fonte de carbono. A combinação dessas técnicas fornece uma ferramenta de avaliação para determinar a capacidade metabólica de um microrganismo quando cultivado em resíduos de fábricas de celulose, como o licor negro. O uso de tais técnicas também oferece informações sobre o valor da aplicação de microrganismos específicos aos resíduos da fábrica de celulose para a geração de subprodutos.

Protocolo

1. Coleta de Licor Negro e Preparação de Licor Negro para Culturas de Crescimento

1. Colete uma amostra de licor preto da válvula de saída conectada ao digestor kraft em uma garrafa de vidro estéril e deixe-a esfriar até a temperatura ambiente antes de prosseguir com as seguintes etapas.
   neutralização
2. Adicionar 100 ml de amostra de licor negro a um copo de 500 ml equipado com um agitador.
3. Coloque o copo em uma placa de agitação e ajuste a velocidade para média.
4. Adicione lentamente gotas de ácido fosfórico até que o licor negro se torne viscoso (viscosidade semelhante ao glicerol).
5. Alicote toda a solução de licor preto despejando lentamente em tubos cônicos de 50 ml e centrifugue a 9.300 x g por 30 min.
6. Colocar o sobrenadante no copo e medir o pH com fitas de teste de pH. O pellet de lignina precipitada pode ser descartado e tratado como resíduo sólido não perigoso.
7. Continue a adicionar ácido fosfórico e centrifugue a solução até que as tiras de pH indiquem um pH neutro do sobrenadante.
   esterilização
8. Passe a solução por um filtro de 0,22 μm para remover qualquer bactéria contaminante e coloque a solução filtrada em um recipiente estéril para armazenamento. Armazene em temperatura ambiente.

2. Extração de lignocelulose

Separação de carboidratos

1. Colocar 5 g de switchgrass, pinheiro ou erva-bermuda (moídos a 1 mm ou a uma granulometria inferior) num erlenmeyer de 500 ml. Em seguida, adicione 200 ml de água destilada ou deionizada, 7,5 g de NaClO₂, 2,5 ml de ácido acético glacial e uma barra de agitação ao frasco.
2. Colocar o balão num banho de óleo colocado em cima de uma placa de agitação a 80 °C durante 1 hora. Ajustar a velocidade da placa de agitação para média.
3. Adicionar ao balão mais 7,5 g de NaClO₂ e 2,5 ml de ácido acético glacial. Continue mexendo a 80 °C no banho de óleo por 30 min.
4. Repita o passo anterior 2x (Nota: um total de 30 g de NaClO₂ e 10 ml de ácido acético glacial são adicionados ao frasco contendo a biomassa lignocelulósica). Resfrie a solução à temperatura ambiente.
5. Coloque uma folha de papel de filtro em um funil Büchner. Coloque o funil em cima de um frasco de braço lateral e conecte-o a um aspirador.
6. Despeje lentamente a solução no funil.
7. Lave o material sólido 3x com 100 ml de água destilada ou deionizada. Descarte o filtrado após lavar o material sólido.
8. Reserve 1 g do material sólido e coloque-o sobre uma folha limpa de papel de filtro.
9. Seque este material sólido durante a noite em um forno a 50 °C. Depois de retirar a amostra da estufa, coloque num frasco para injetáveis de armazenamento rotulado como 'holocelulose'.
10. Adicionar o material sólido restante a 250 ml de NaOH a 10% (v/v) num erlenmeyer de 500 ml. Tampar o balão com uma rolha.
11. Colocar a solução numa estufa a 70 °C durante 1 hora agitando a 250 rpm.
12. Arrefecer a solução durante 30 min à temperatura ambiente.
13. Remover o material sólido com papel de filtro e funil de Büchner fixado a um balão de braço lateral.
14. Transferir o material sólido para uma folha limpa de papel de filtro para uma estufa a 50 °C e deixar secar durante a noite.
15. Depois de o resíduo ter secado, coloque-o num frasco de armazenamento e rotule-o como "celulose".
16. Transferir o filtrado do passo 2.13 para um erlenmeyer de 500 ml e adicionar 30 ml de ácido acético e 250 ml de álcool isopropílico. Tampe o frasco e coloque a solução na bancada por pelo menos 8 horas à temperatura ambiente.
17. Transfira toda a solução para tubos cônicos de 50 ml e centrifugue a solução a 9.300 x g por 30 min. Pipete cuidadosamente a solução para fora do tubo cônico e descarte.
18. Ressuspender o pellet em 30 ml de água destilada ou desionizada por vórtice.
19. Repita as etapas 2.17-2.18 15x para lavar bem o pellet.
20. Remova o sobrenadante e guarde o pellet para liofilização. Depois de liofilizada, colete a amostra e coloque-a em um frasco rotulado como 'hemicelulose'.
    Separação de lignina
    Protocolo de separação de lignina baseado em Karaaslan et al. ¹²
21. Adicionar 5 g de switchgrass, pinheiro ou erva-bermuda (moída a 1 mm ou a um tamanho de partícula inferior) a 500 ml de uma solução de NaOH 0,25 M e etanol a 30%. Colocar o chorume numa incubadora a 75 °C com agitação a 250 rpm durante 2 horas.
22. Resfrie a solução à temperatura ambiente.
23. Colocar uma folha de papel de filtro num funil de Büchner em cima de um balão de braço lateral. Conecte a um aspirador e despeje lentamente a solução no funil.
24. Descarte o material sólido.
25. Adicionar um pé de agitação ao balão que contém o filtrado e colocar o balão sobre uma placa de agitação regulada para velocidade média. Adicionar ácido clorídrico concentrado gota a gota à solução até obter um pH de 2,0 (aproximadamente 20 ml).
26. Deixe a solução acidificada descansar durante a noite em temperatura ambiente.
27. Centrifugue a solução a 9.300 x g por 30 min em tubos cônicos. Pipetar cuidadosamente a solução para fora do tubo cónico e eliminar.
28. Ressuspender o pellet em 30 ml de água destilada ou desionizada por vórtice.
29. Repita as etapas 2.27-2.28 15x para lavar bem o pellet.
30. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e guarde o pellet para liofilização. Depois de liofilizada, coloque a amostra em um frasco rotulado como 'lignina'.

3. Preparação de culturas de crescimento microbiano

Placas de ágar

1. Adicione 0,2% (p / v) de produtos de extração de lignocelulose estéreis ao ágar M9 de meio mínimo¹³ antes de despejar as placas.
2. Placas solidificadas com aproximadamente 200 ul de uma cultura bacteriana cultivada em meio mínimo M9 com um OD de aproximadamente 2,0.
3. Incubar placas a 37 °C e monitorar o crescimento.
   Culturas líquidas
4. Adicionar 50 ml de meio Luria-Bertani (LB)¹³ ou M9¹³ esterilizado a um balão esterilizado de 125 ml. Adicione licor negro a 10% (v/v) ou 0,2% (p/v) de produtos de extração de lignocelulose.
5. Inocular o meio com 0,1% (v/v) de uma cultura bacteriana a uma diâmetro externo de aproximadamente 2,0.
6. Incubar as culturas a 37 °C com agitação a 200 rpm.
7. Avalie o crescimento a cada 6 horas durante o período de cultura medindo a densidade óptica (λ = 600 nm). Colocar uma alíquota de 1 ml da cultura numa cubeta. Determinar a densidade óptica da cultura em branco contra meios não inoculados.
8. Transfira as bactérias para um frasco de soro anaeróbico no meio da fase logarítmica.
   1. Para preparar o frasco de soro anaeróbico: feche o frasco de soro com uma rolha de borracha butílica e uma tampa de crimpagem de alumínio em condições aeróbicas e autoclave. Não modifique o espaço livre dentro do frasco de soro após a esterilização.
   2. Transferir toda a cultura de 50 ml do balão de 125 ml para o frasco de soro estéril selado, utilizando uma seringa.
   3. Incubar a 37 °C com agitação a 200 rpm.

4. Preparação de amostras para GC-MS

Prepare amostras de acordo com Raj, Reddy e Chandra¹⁴. O controle negativo usado para comparação consiste em meio mínimo M9 com 10% de licor negro e também é chamado de amostra não inoculada.

1. Centrifugar culturas bacterianas não inoculadas e inoculadas (50 ml) a 9.300 x g por 30 min após 450 horas de incubação.
2. Transferir 10 ml do sobrenadante para um tubo de ensaio de vidro. (Observação: o plástico é incompatível com os produtos químicos nas etapas a seguir.)
3. Acidifique o sobrenadante com HCl concentrado a pH 1-2.
4. Adicione 3 volumes de acetato de etilo (30 ml), tampe o tubo e misture invertendo 4-6x.
5. Coloque uma pequena quantidade de Na₂SO₄ anidro (1-2 g) em um tubo de ensaio de vidro limpo.
6. Recolha cuidadosamente a camada orgânica (topo) da solução de acetato de etilo pipetando com uma pipeta Pasteur de vidro descartável.
7. Coloque a camada orgânica no tubo de ensaio com Na_{anidro 2}SO₄.
8. Desidrate a camada orgânica sobre Na_{anidro 2}SO₄ batendo suavemente no tubo de ensaio para misturar. Aos poucos, adicione pequenas quantidades de Na_{anidro 2}SO₄e misture até que não haja grandes aglomerados.
9. Coloque uma folha de papel de filtro em um funil Büchner em cima de um balão de braço lateral preso a um aspirador.
10. Despeje a solução no funil. Descarte o material sólido.
11. Transferir a solução para um balão de evaporação e evaporar o filtrado utilizando um evaporador rotativo.
12. Colocar 3 mg de resíduo de extracção de acetato de etilo num frasco para injetáveis de cromatografia âmbar de 2 ml.
13. Dissolver o resíduo com a adição de 100 μl de 1,4-dioxano e 10 μl de piridina.
14. Adicionar 50 μl de N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida com trimetilcolorsilano 99:1% (BSTFA). Em seguida, coloque em uma incubadora a 60 °C com agitação por 15 min.
15. Conservar as amostras a 4 °C até à utilização.

5. GC-MS

Equipar o cromatógrafo de fase gasosa (GC) com interface com um espectrómetro de massa (MS) com uma coluna capilar apolar e hélio como gás de arraste com um caudal de 1 ml/min.

1. Depois de estabilizar a temperatura da estufa a 50 °C, injectar 1 μl da amostra com uma proporção de divisão de 1/50.
2. Manter a coluna a 50 °C durante 5 min e aumentar para 280 °C a 5 °C/min. Manter a temperatura final de 280 °C durante 20 min.
3. Manter a linha de transferência entre o cromatógrafo de fase gasosa e o espectrómetro de massa a 300 °C.
4. Selecione um atraso de solvente de 15 min.
5. Registre os espectros de massa de ionização de elétrons entre a faixa de 10-500 (m / z) com energia eletrônica de 70 eV.
6. Derivatizar e cromatógrafo padrão como acima. Identifique compostos comparando os tempos de retenção de padrões ou dados adquiridos no banco de dados espectral de massa do National Institute of Standards and Technology (NIST).

Resultados

A coleta e modificação do licor negro gerado no processo de polpação kraft (Figura 1) permitirá utilizar esse resíduo de polpação para determinar a capacidade de biodegradação de um único isolado bacteriano ou cultura mista. A Figura 2 mostra o crescimento aeróbio medido pela densidade óptica do isolado ambiental microbiano cultivado apenas em meio LB e meio LB suplementado com 10% de licor negro neutralizado. Esses resultados indicam que essa bactéria cresce na presença de licor negro n...

Discussão

Este protocolo descreve uma combinação de técnicas que visa identificar microrganismos que podem degradar os resíduos de polpação, as fontes de carbono utilizadas durante o crescimento em resíduos de polpação e os produtos metabólicos microbianos produzidos quando cultivados em resíduos de polpa. Mostramos o sucesso deste protocolo com o isolado ambiental microbiano: um anaeróbio facultativo que pode crescer com 10% de licor negro e usar os componentes de extração de lignocelulose como únicas fontes de carbono para o cre...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,4-Dioxano (Certificado ACS)	Fisher	D111	Inflamável, químico pré-oxidável
Licor Negro	Departamento de Biomateriais Florestais da Universidade Estadual da Carolina do Norte	N / A	pH 12,72, 13,67% sólidos
Etanol (grau microbiológico)	Fisher	BP2818
Acetato de etila (grau de reagente ACS)	EMD	EX0240-9	Inflamável
Ácido acético glacial (ACS certificado)	EMD	AX0073	Guaiacol corrosivo
	Sigma Aldrich	PHR1136	Nocivo por ingestão,
coluna capilar HP-5	Agilent	19091J-577	60 m x 0,18 mm de diâmetro interno, 0,18 μ m de espessura
Ácido clorídrico (certificado ACS)	EMD	HX0603P
N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida com trimetilclorosilano 99:1% (BSTFA)	Fluka	15238	Inflamável, causa queimaduras na pele e lesões oculares com contato
Na2SO4 (grau FCC)	VWR	BDH8026
NaClO2 (80%)	Sigma Aldrich	244155	Inflamável, tóxico
NaOH (certificado ACS)	EMD	1.06498.1000
Fitas de teste de pH Alkacid Corrosivo	Ácido	A979
(certificado ACS)	Espectrômetro de massa Fisher	A242
Polaris Q	Thermo Electron Corporation
Piridina (99%)	Alfa Aesar	A12005	Inflamável, tóxico em contato com a pele
Switchgrass	Cherry Research Farm Goldsboro, NC	N/A	Colhido em agosto de 2011
Cromatógrafo de gás traço Thermo Finnigan	Thermo Electron Corporation
Whatman no. 1 papel de filtro	Whatman	1001-150