Nucleosídeos Trisfosfatos - Da síntese à Caracterização Bioquímica

Resumo

O protocolo aqui descrito visa explicar e resumir os numerosos obstáculos no caminho da rota intrincada levando a trifosfatos de nucleosídeos modificados. Consequentemente, este protocolo facilita tanto a síntese desses blocos de construção ativados e sua disponibilidade para aplicações práticas.

Resumo

A estratégia tradicional para a introdução de funcionalidades químicas é a utilização de síntese em fase sólida, anexando precursores fosforamideto adequadamente modificados para a cadeia nascente. No entanto, nas condições utilizadas durante a sintese e a restrição de sequências curtas em vez dificultar a aplicabilidade desta metodologia. Por outro lado, trifosfatos de nucleósidos modificados são activados os blocos de construção que têm sido empregues para a introdução suave de numerosos grupos funcionais nos ácidos nucleicos, uma estratégia que abre o caminho para a utilização de ácidos nucleicos modificados numa paleta ampla de aplicações práticas como marcação funcional e geração de ribozimas e DNAzymes. Um dos maiores desafios reside na complexidade da metodologia conduz ao isolamento e caracterização destes análogos de nucleósidos.

Neste artigo de vídeo, que apresentam um protocolo detalhado para a síntese de these análogos modificados utilizando reagentes baseados em fósforo (III). Além disso, o procedimento para a sua caracterização bioquímica é divulgada, com uma ênfase especial em reações de extensão de primers e polimerização tailing TdT. Este protocolo detalhado será de uso para a elaboração de dNTPs modificados e seu posterior uso em biologia química.

Introdução

Trifosfato 5'-nucleosídeos ((d) PNT) representam uma classe de biomoléculas vitais que estão envolvidos em inúmeros processos e funções que vão desde a ser a moeda universal de energia para os reguladores do metabolismo celular. Em adição ao seu papel nestas transformações biológicas fundamentais, os seus homólogos modificados têm avançado como uma plataforma versátil e leve para a introdução de grupos funcionais em oligonucleótidos, uma metodologia bem que complementa a síntese em fase sólida automatizada, que é normalmente aplicada ^1,2. De fato, desde que os (d) PNT pode atuar como substratos para RNA e DNA polimerases ^3, uma grande ....

Protocolo

1. Síntese dos nucleósidos modificados Trisfosfatos

A abordagem sintética escolhido segue o procedimento desenvolvido por Ludwig e Eckstein uma vez que este método é geralmente fiável e conduz a muito poucos sub-produtos secundários (Figura 1A) ^39.

1. Coevaporate do nucleósido apropriadamente protegido-3'-OAc (tipicamente 0,1 mmol) duas vezes com piridina anidra (2 ml) e, em seguida, seco sob vácuo durante a noite. Ao mesmo tempo, o pirofosfato de tributilamónio seca (0,13 mmol) sob vácuo durante a noite.
2. Dissolve-se o nucleósido, num mínimo de piridina seca (0,2 ml) e adiciona-dioxano sec....

Resultados

Trifosfatos de nucleosídeos modificados são atraentes alvos sintéticos, uma vez que permitem a introdução fácil de um vasto leque de grupos funcionais em ácidos nucléicos ^41. No entanto, o isolamento e caracterização desses blocos de construção é frequentemente activadas revelaram ser difícil. Consequentemente, os resultados aqui apresentados são pensados ​​para oferecer uma mão amiga para acompanhar as diversas etapas dentro dos procedimentos sintéticos e bioquímicos acima mencionados (Figura 1B).

Discussão

A inclusão de modificações nos ácidos nucléicos é de interesse para inúmeras aplicações práticas, incluindo o desenvolvimento de agentes anti-senso e antigène ^42,43, rotulagem e etiquetagem funcional de oligonucleotídeos ^41, e em esforços para expandir o alfabeto genético ^44-46. Alterações químicas e grupos funcionais são geralmente introduzidas em ácidos nucleicos por aplicação de protocolos de síntese em fase sólida padrão e automatizadas. No entanto, os blocos de construção de fosfora.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pirofosfato de tributilamônio	Sigma Aldrich	P8533	Sólido higroscópico, mantido sob Ar
2-Cloro-1,3,2-benzodioxafosforina-4-ona	Sigma Aldrich	324124	Pyridina sensível à umidade
	Sigma Aldrich	82704	Peneiras moleculares
Dioxano	Sigma Aldrich	296309	Peneiras moleculares
Dimetilformamida (DMF)	Sigma Aldrich	40248	Peneiras moleculares
Acetonitrila	Fisher Scientific		HPLC grau
Trietilamina	Sigma Aldrich	90342
Tributilamina	Sigma Aldrich	90781
ddH2O	Milli-Q		água deionizada e purificada, autoclavada na presença de dietilpirocarbonato (DEPC)
Dietilpirocarbonato (DEPC)	Sigma Aldrich	159220
D2O	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-25
γ-[32P]-ATP	Hartmann Analytics	FP-301
Natural dNTPs	Promega	U1420
Vent (exo-) DNA polimerase	NEB	M0257S
DNA polimerase I, Fragmento Grande (Klenow)	NEB	MO210S
9° Nm DNA polimerase	NEB	MO260S
Terminal desoxinucleotidil transferase (TdT)	Promega	M828A
Pwo DNA polimerase	Peqlab	01 01 5010
T4 PNK	Thermo Scientific	EK0032
Acrilamida / bisacrilamida (19:1, 40%)	Serva	10679.01
Agarose	Apollo Scientific	BIA1177
G10 Sephadex	Sigma	G10120
Ureia	Apollo Scientific	BIU4110
Júpiter coluna semipreparativa RP-HPLC (5μ C18 300 Å)	Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler	Bioconcept	BYQ6042E
Frascos de PCR	Sistema HPLC Bioconcept	3220-00
	Amersham Pharmacia Biotech		Ä kta basic 10/100
Todos os oligonucleotídeos foram comprados da Microsynth e purificados por PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
Mais informações sobre procedimentos e equipamentos experimentais podem ser encontradas nos seguintes artigos: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F