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Uma In vivo A reticulação Abordagem para isolar Complexos de proteínas a partir de Drosophila Os embriões

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DOI:

10.3791/51387

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23 de abril de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

Neste artigo

Resumo

Complexos de proteínas multi-componentes desempenham um papel crucial durante a função celular e desenvolvimento. Aqui, descrevemos um método usado para isolar complexos proteína nativa a partir de embriões de Drosophila após reticulação in vivo seguido de purificação dos complexos de ligações cruzadas para a subsequente análise da estrutura-função.

Resumo

Muitos processos celulares são controlados por complexos de proteína de múltiplas subunidades. Freqüentemente, esses complexos formam transitoriamente e exigem ambiente nativo de montar. Portanto, para identificar estes complexos proteicos funcionais, é importante para estabilizar in vivo antes da lise das células e purificação subsequente. Aqui nós descrevemos um método utilizado para isolar grandes complexos de proteínas de boa-fé a partir de embriões de Drosophila. Este método baseia-se na permeabilização embrião e estabilização dos complexos no interior dos embriões por reticulação in vivo, utilizando uma baixa concentração de formaldeído, o que pode facilmente atravessar a membrana celular. Subsequentemente, o complexo de proteína de interesse é imunopurificada seguido de purificação em gel e analisados ​​por espectrometria de massa. Ilustraremos este método utilizando a purificação de uma proteína complexa Tudor, que é essencial para o desenvolvimento da linha germinativa. Tudor é uma grande proteína, que contém vários domínios Tudor - pequenomódulos que interagem com argininas metiladas ou lisinas de proteínas alvo. Este método pode ser adaptado para o isolamento de complexos de proteína nativa a partir de diferentes organismos e tecidos.

Introdução

Isolamento de conjuntos de proteínas de subunidades múltiplas e complexos de ADN ou ARN-proteína é realizada para identificar complexos proteicos, locus genómico reconhecidos pelas proteínas reguladoras de ligação de ADN ou de ARN alvos de proteínas de ligação a ARN. Diferentes métodos permitem a identificação do genoma de sites de DNA reconhecidos por fatores de transcrição ou proteínas da cromatina (Chip-seq) 1 e metas de RNA associadas a uma determinada proteína de ligação de RNA (CLIP-seq) 2. As bibliotecas do ADNc derivado de ARN-ou alvos de DNA são então profundamente sequenciado. Estes métodos utilizam química ou reticulação para estabilizar os complexos seguido por imunoprecipitação (IP), com um anticorpo contra um componente proteico do complexo estudado induzida por UV.

Durante o desenvolvimento de um organismo, muitos complexos de proteínas formam transitoriamente. Portanto, é essencial analisar a composição e função dos complexos in vivo para compreender os mecanismos moleculares que controlam devolvimento. Tal análise in vivo seria superior à abordagem in vitro, uma vez que é virtualmente impossível reproduzir concentrações nativas dos componentes que interagem e ambiente bioquímico celular in vitro. Aqui demonstramos uma abordagem in vivo que utilizam com sucesso para isolar grandes complexos de proteínas a partir de embriões de Drosophila. Neste método, os complexos de proteína em embriões vivos são reticulados com um baixo teor de formaldeído e, subsequentemente, os complexos de proteína de interesse é isolado por IP com um anticorpo contra um componente conhecido dos complexos, seguida de purificação em gel dos complexos e análise de espectrometria de massa para identificar componentes complexos desconhecidos. Uma vez que o formaldeído é capaz de permear a membrana celular e possui um intervalo de reticulação de 2,3-2,7 Å 3, complexos de proteína, pode ser reticulado in vivo, e os componentes do complexo são susceptíveis de estar perto um do outro. Neste artigo,descrever este método usando o isolamento de Tudor (Tud) complexo de proteína como um exemplo. Tud é uma proteína da linha germinativa, que é essencial para o desenvolvimento da linha germinativa 4-7. Esta proteína contém 11 domínios TuD conhecidas por interagirem com argininas metiladas ou lisinas de outros polipeptídeos 8-10.

Anteriormente, têm gerado uma linha de Drosophila transgênica que expressa HA-marcado funcional Tud 5 e, portanto, o anticorpo anti-HA específico é utilizado para puxar para baixo complexo Tud após reticulação.

Em adição a ligações cruzadas de proteína-proteína, o formaldeído pode gerar ácido nucleico ligações cruzadas em proteína e é usado em experiências de ChIP-seq. Além disso, em Drosophila, in vivo, de ligação cruzada com formaldeído, permitiu a identificação de um alvo de ARN da proteína helicase vasa ARN 11.

Enquanto neste artigo descrevemos um método para a reticulação vivo e purificação de complexos de proteínas a partir de embriões de Drosophila, este método pode ser adaptado para outros organismos e os tecidos.

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Protocolo

1. Preparando grandes da Apple Juice Placas-ágar

  1. Para fazer quatro placas, adicionar 375 ml de H 2 O, 11,25 g de agar mosca e uma barra de agitação para um balão de 1000 ml. Este é Mix A. Autoclave Mix Um frasco com a tampa solta tampado em um ciclo de 30 min-esterilização para produtos líquidos.
  2. Adicione 125 ml de suco de maçã, 12,5 g de açúcar de mesa e uma barra de agitação para um copo de 500 ml. Esta mistura é B. Calor mistura B numa plataforma aquecida enquanto se agita e mantém a temperatura a cerca de 70 ° C até que a autoclave de mistura A é terminado.
  3. Após a conclusão da Mix A autoclavagem, transferir Mix B para A. Misture Continue mexendo a mistura combinada com cuidado e deixe esfriar por 15 min. Evitar a sobre-arrefecimento e a solidificação de agar resultou antes da adição de conservante.
  4. Adicione 10% (peso / volume) de solução de metil 4-hidroxibenzoato de metilo em etanol. Isto irá actuar como um conservante. Adicionar 3,75 mL da solução para a mistura de sumo de maçã-agar acima. Continue mexendo por another 5 min.
  5. Despeje 125 ml mistura de suco de maçã-agar com conservante em cada 300 cm 2 de plástico ou placa de isopor. Deixe esfriar para RT e solidificar. Evite a formação de bolhas de ar ao derramar.
    Nota: As placas-ágar suco de maçã está pronto para usar imediatamente. Cobrir as placas não utilizadas com envoltórios claras e armazenar a 4 ° C durante até uma semana.

2. Colheita de embriões Drosophila e Tratamento de pré-reticulação

  1. Coloque uma gaiola população com cerca de 40.000 a 50.000 moscas a partir do qual os embriões serão coletados.
  2. Faça duas placas, cada uma contendo 125 ml de farinha de milho-padrão médio melaço 12 e polvilhe aproximadamente 4 g de fermento de padeiro seco em cada placa. Coloque estas placas na gaiola população em uma incubadora a 25 ° C por 48 horas para engordar as moscas.
  3. Aqueça 2 maçã placas suco-ágar a 25 ° C. Polvilhar aproximadamente 1 g de levedura de padeiro seca em cadaprato. Coloque as duas placas na gaiola população para começar a coletar 0-1 embriões hr de idade.
  4. Retire das placas no final da recolha de 1 hora. Substitua com 2 placas novas, se for necessário mais uma rodada de coleta.
  5. Adicionar água suficiente para cobrir as placas e ressuspender os embriões suavemente com um pincel fino. Despeje os embriões ressuspensão através de uma peneira de duas camadas feitas de malha de arame de aço inoxidável.
    Nota: A camada superior é feita de tamanho de poros médio (850 mm) de malha que reúne grande parte da mosca, deixando através de embriões. A camada inferior é feita de malha fina (75 mm) que recolhe embriões, deixando através de levedura e água.
  6. Use o pincel fino tinta para transferir os embriões coletados em uma cesta coleção feita com um tubo de 50 ml e de malha fina de nylon. Lavar os embriões brevemente com água, em seguida, seque a malha em papel toalha para secar.
  7. Mergulhe os embriões em 50% água sanitária com agitação suave por 3 min. Enxágüe completaly com água para remover qualquer remanescente de branqueamento. Blot a malha em papel toalha para secar.
  8. Mergulhe os embriões dechorionated em isopropanol com agitação suave durante 15 segundos ou até que a quebra de aglomerados multi-embrião (isso não deve demorar mais do que 30 segundos). Blot a malha em papel toalha para secar completamente.
  9. Mergulhe os embriões em heptano por 5 minutos enquanto estiver usando uma pipeta para transmitir heptano sobre os embriões para mantê-los ressuspenso. Blot a malha em papel toalha para secar.
  10. Lavar os embriões com fluxos de fosfato salino tamponado, pH 7,4 (PBS) contendo 0,1% de Triton X-100 (PBST) durante 3 min.
  11. Desmontar o cesto de recolha e transferência de embriões, juntamente com a malha para um tubo de 15 ml contendo 10 ml de PBST. Inverter o tubo suavemente para lavar os embriões fora da malha.
  12. Retirar a malha do tubo. Colocar o tubo na posição vertical, e deixar os embriões afundar para o fundo do tubo por gravidade.
    Nota: Cerca de 100-300mL de embriões é esperado para uma coleção de 1 hora a partir de uma gaiola.
  13. Remover o PBST e continuar a realizar a reticulação imediatamente.

3. In vivo A reticulação dos embriões colhidos

  1. Prepare a 0,2% de formaldeído em PBST imediatamente antes da utilização. Adicionar 10 ml de formaldeído para o fixador os embriões e incubar a 25 ° C com agitação suave num agitador rotativo durante 10 min. Descarte fixador não utilizados até o final do dia.
  2. Extingue-se a reacção de reticulação
    1. No final da reticulação, deixar os embriões afundar para o fundo do tubo.
    2. Remover a solução de formaldeído. Imediatamente adicionar 10 ml de 0,25 M de glicina em PBST para extinguir a reacção de reticulação. Incubar a 25 ° C com agitação suave num agitador rotativo, durante 5 min.
    3. Deixe os embriões afundar para o fundo do tubo. Remover a solução de resfriamento. Lavar os embriões com 10 mL de PBST três vezes.
    4. Remover completamente o PSolução de lavagem BST com uma pipeta. Armazenar embriões a -80 ° C até à sua utilização.

4. Proteína Preparação de Amostras e Immunoprecipitation

  1. Homogeneizar 500 ul embriões reticulados utilizando um homogeneizador Dounce, em 2 ml de tampão de lise (0,5 M de ureia, 0,01% de SDS, 2% de Triton-X 100, fluoreto de fenilmetanossulfonilo 2 mM [FPMS], e cocktail inibidor de protease em PBS).
    Nota: Execute este e os seguintes passos na RT, a menos que especificado em contrário.
  2. Transferir o lisado para tubos de 1,5 ml de centrífuga e agitar suavemente sobre uma plataforma rotativa durante 15 minutos para assegurar a lise completa. Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g durante 5 min para sedimentar os detritos celulares. Salve o sobrenadante em um tubo de 15 ml limpo.
  3. Adicionar 40 ul de contas de agarose anti-HA lama para o sobrenadante e incubar numa plataforma rotativa durante 2,5 horas.
  4. Sedimentar as pérolas por centrifugação a 2500 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante, mas deixar adeximately 250 mL no tubo. Ressuspender as esferas no sobrenadante remanescente e transferidos para uma coluna de centrifugação de 1,5 ml com 10 mM de filtro poroso.
  5. Centrifugar a coluna girar a 12.000 xg por 10 segundos e descartar o fluxo através.
  6. Lave os grânulos por adição de 200 ul de tampão de lavagem (0,1 M de glicina, 1 M de NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% de Tween-20, em PBS). Centrifugar a coluna a 12.000 xg por 10 segundos e descartar a lavagem. Repita a lavagem mais duas vezes.
  7. Adicionar 40 ul de tampão de eluição (2 mg / ml de HA-péptido em PBS) às pérolas e incubar a 37 ° C durante 15 min com agitação suave a cada 5 min. Centrifugar a 12000 xg durante 10 seg e recolher o eluato.
  8. Confirmar eluição do complexo por análise de Western-blot, utilizando um anticorpo anti-HA 13.

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Resultados

A eficácia da reticulação e a purificação com sucesso do complexo proteico reticulado Tud foram analisadas por SDS-PAGE em um 3% - gel de 7% etapa (ilustrada na Figura 1), seguido por transferência de Western (Figura 2).

O objectivo de utilizar a 3% - 7% de gel passo é baseado na separação eficaz de complexo de proteína reticulada Tud da proteína Tud reticulada remanescente e a concentração do complexo. Sob as nossas condições in vivo de reticulação...

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Discussão

O formaldeído foi utilizada como um reagente de ligação cruzada para a identificação da proteína-proteína e interacções proteína-ácido nucleico. A sua boa solubilidade e permeabilidade da membrana da célula, juntamente com a compatibilidade com os procedimentos de espectrometria de massa a jusante, fazer formaldeído um agente candidato ideal para aplicações de reticulação intracelulares 3,15-17. Em particular, foi utilizado com sucesso para identificar mRNAs associados com vasa, uma helicase de ARN de células...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler e Jimiao Zheng por sua ajuda técnica com este estudo. Este trabalho foi financiado pela NSF CARREIRA conceder MCB-1054962 para ALA

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Drosophilaágar Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1Não autoclave a mistura de água e ágar por um período prolongado de tempo, pois isso fará com que as placas de suco de maçã se tornem frágeis
Metil 4-hidroxibenzoatoSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501Outro nome: TEGOSEPT
Gaiola populacionalFlystuff ( http://www.flystuff.com/)59-104
Malha de nylon finaFlystuff (http://www.flystuff.com/)57-102Ao fazer a cesta de coleta, corte a malha um pouco maior do que a abertura da tampa do tubo de falcão para garantir uma vedação firme
Homogeneizador DounceSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SETResfrie o homogeneizador no gelo e pré-enxágue com tampão de lise fria antes de usar para prevenir a degradação da proteína
Coquetel inibidor de protease Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001PBS pode ser usado para preparar solução estoque concentrada de inibidor de protease
Contas de agarose anti-HAMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8O kit também inclui colunas de peptídeo HA e colunas
de spin Peptídeo HAMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Prepare para 2 mg/ml com PBS 
Coluna de fiaçãoMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8As colunas de fiação estão incluídas como parte do kit
IsopropanolFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)
Triton X-100Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP151-500
HeptanoFisher Científico (www.fishersci.com/‎)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625Diluir de 10X a 1X com água nanopura antes do uso
FormaldeídoFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP531-500
GlicinaBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDSBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0301
UréiaBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0730
Fluoreto de fenilmetanossulfoniloSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1GPrepare a solução-mãe de 200 mM em isopropanol e dilua até a concentração de trabalho de 2 mM em tampão de lise
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
Tween 20Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP337-100
Tubos de 15 mlUSA Scientific (http://www.usascientific.com/)1475-0511
AlvejanteMarcaDiluir com igual volume de água nanopura para fazer 50% de alvejante
Tubos de 50 mlBD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
Peneira de camada superiorFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1AK
Peneira inferiorFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1BA
BP26324 Clorox

Referências

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