Longo prazo intravital Imunofluorescência imagem do tecido componentes da matriz com epifluorescência e microscopia de dois fótons

Resumo

A matriz extracelular sofre remodelação substancial durante a cicatrização de feridas, inflamação e tumorigênese. Nós apresentamos uma abordagem microscopia de imunofluorescência intravital romance de visualizar a dinâmica de fibrilar, bem como componentes da matriz de malha-like com resolução espacial e temporal alta usando epifluorescência ou microscopia de dois fótons.

Resumo

Além de ser um andaime física para manter a morfologia de tecido, a matriz extracelular (ECM) é activamente envolvido na regulação da função das células e dos tecidos durante o desenvolvimento e homeostasia de órgãos. Fá-lo, agindo através de vias de sinalização bioquímicas, biomecânicas e biofísicas, tais como através da liberação de fragmentos de proteínas ECM bioativos, que regula a tensão do tecido, e fornecendo caminhos para a migração celular. A matriz extracelular do microambiente do tumor sofre remodelação substancial, caracterizado por a degradação, deposição e organização das proteínas de matriz fibrilar e não-fibrilares. Estroma endurecimento do microambiente do tumor pode promover o crescimento tumoral e a invasão, e fazer com que a remodelação dos vasos sanguíneos e linfáticos. Imagens ao vivo de proteínas da matriz, no entanto, que este ponto é limitada a colagénios fibrilares que podem ser detectados por uma segunda geração de harmónicas usando microscopia multi-fotão, deixando a maior parte dos componentes da matriz largely invisível. Aqui nós descrevemos os procedimentos de inoculação do tumor na pele dorsal ouvido fino, imunomarcação de proteínas da matriz extracelular e de imagem intravital do tecido exposto em ratos vivos usando epifluorescência e microscopia de dois fótons. O nosso método de imagem intravital permite a detecção directa de ambas as proteínas da matriz fibrilar e não fibrilares no contexto de um tumor em crescimento dérmica. Mostramos exemplos de remodelação navio causadas pela contração da matriz local. Descobrimos também que a matriz fibrilar do tumor detectado com a geração de segundo harmônico é espacialmente distintas das componentes da matriz recém-depositados como tenascin C. Também mostramos a longo prazo (12 horas) de imagens de interação de células T com células tumorais e células tumorais migração ao longo do colágeno IV da membrana basal. Tomados em conjunto, este método permite exclusivamente para a detecção simultânea de células de tumor, o seu microambiente físico e o tecido da resposta imune endógeno ao longo do tempo, o que pode provide importantes insights sobre os mecanismos subjacentes a progressão do tumor e do sucesso ou resistência à terapia definitiva.

Introdução

Imagens intravital de processos de remodelação inflamatório, metastáticos e de matriz tem sido uma importante área de pesquisa e tem motivado a criação de inúmeros modelos de ratos transgênicos repórter que expressam proteínas fluorescentes ^1,2. Devido aos sinais de falta de foco fluorescentes, que reduzem a qualidade de imagem e limites iluminam penetração através do tecido, tecido grosso de imagem só é possível com ou microscopia confocal multi-fotão ^3. Usando mais rápido, microscopia de epifluorescência, menos caro e complexo só é possível com os tecidos quase bidimensionais, tais como o frango cório-alantóica membrana ⁴ ou ⁵ da orelha de rato derme. A maioria dos sistemas de imagem tirar proveito de ratinhos transgénicos que expressam várias proteínas fluorescentes de uma forma específica do tipo de célula. Embora estas proteínas oferecer fototoxicidade fraco, induzem a resposta imune ^6. Além disso, é difícil para alternar entre os subtipos de células específicos, ou marcar abasal ri ou estados ativados como tal mudança exige a elaboração de um novo modelo genético. Além disso, como a expressão da proteína fluorescente é geralmente restrita ao compartimento intracelular, que normalmente não é possível com as estruturas extracelulares de imagem, como as proteínas da membrana basal ou depósitos de quimiocinas tecido ^7. Em vez disso, marcação indirecta com anticorpos contra antigénios extracelulares oferece flexibilidade para virtualmente qualquer componente específico de tipo celular ou de matriz ^8,9. No entanto, a maior desvantagem desta abordagem está associada com a rotulagem imunotoxicidade mediada por complexos imunes de antigénio-anticorpo que podem provocar toxicidade celular dependente do sistema de complemento e a fagocitose de células e estruturas extracelulares ^10.

A matriz extracelular do microambiente do tumor, mas também do tecido normal durante a inflamação ou a cicatrização de feridas, remodelação sofre substancial. Estroma endurecimento do microambiente do tumor pode promoo crescimento do tumor e invasão te devido a mecanismos de sinalização induzida por estresse e causa remodelação de vasos sanguíneos e linfáticos ^11. No entanto, imagens em tempo real de proteínas da matriz é limitada a colagénios fibrilares que podem ser detectados por uma segunda geração de harmónicas usando microscopia multi-fotão. Recentemente, publicou um método de imagiologia intravital novela que minimiza o risco de danos e foto-imunológico-tóxicos para as células e estruturas do tecido espelhados ^5. Em comparação com técnicas de imagem estabelecidos onde a única rodada de visualização intravital contínua está em um intervalo de 30 minutos a 2 horas ^12-17, a nossa imunofluorescência intravital (IF) técnica permitiu 12 horas (de longo prazo) ⁸ imagem. É importante notar que o tempo de imagem é limitada a 12 horas, devido a limites definidos no protocolo animal, mas não há contra-indicações técnicas que não pode ser prolongada se os parâmetros críticos de saúde do animal, tais como pressão arterial e cardíacataxa são controlados ^8. Além disso, por meio de um microscópio estereoscópico fluorescência automatizado fomos capazes de coletar imagens de vários campos durante um único experimento e observou raros processos imunológicos e remodelação que ocorreram no contexto fisiológico da pele apoiado pelo sangue funcional e vasos linfáticos. Porque a lente lupa estereoscópica tem uma relativamente grande, 2 cm, distância de trabalho e em contraste com dois fótons ópticos microscópicos não requer vaporização de imersão em água, a imagem latente de longo prazo foi realizado somente sob fluorescência microscópio estereoscópico. Intravital se permitido a marcação imunológica e a detecção de qualquer componente da matriz extracelular da pele normal. O design desta técnica baseia-se no conceito inovador de usar marcação para as células vivas e elementos de matriz de tecido na derme de rato expostos cirurgicamente sem causar efeitos nocivos imunotóxicos ^5. O procedimento cirúrgico é segura para a dermevasculatura, uma vez que se baseia apenas na separação de duas camadas da pele na orelha, que são inervados de forma independente, autônoma alimentada pelo sangue e drenado por circulações linfáticas distintas. Nossa configuração experimental permite imagens de uma série de eventos importantes fisiopatológicas mais de pelo menos 12 horas, incluindo o tráfico de leucócitos entre vasos sanguíneos e linfáticos e os processos de cicatrização de feridas. Na publicação original, comparamos a nossa técnica de state-of-the-art normas em vários campos da imagem intravital. Consequentemente, observou-se o extravasamento de vasos sanguíneos e linfáticos eventos intravasation por vários tipos de leucócitos, incluindo a visualização única de células imunes que entram recolha em vez de esperar vasos linfáticos iniciais ^15. Além disso, complementando as observações feitas por outros grupos ^9,18, descobrimos que em CCL21 vivo é capaz de formar, depósitos descontínuos fortes sobre a coleta, mas apenas raramente em vasos linfáticos iniciais.

Aqui nós descrevemos um intravital modificado IF técnica que pode ser combinado com microscopia de dois fótons para detectar rede de colágenos fibrilares usando geração de segundo harmônico (SHG). Mostra-se que este método também pode ser utilizado para a invasão de células de cancro de imagem em contexto do microambiente tumoral dinâmico, que inclui moléculas da matriz, tais como a tenascina C, que são muito pouco explorado por meio de técnicas de imagiologia correntes ^19. Descobrimos que a matriz fibrilar de tumor, detectado com a segunda geração de harmónicas, ocupa diferentes locais do microambiente do tumor do que a matriz depositada de novo composto da tenascina C. Além disso, nós descrevemos exemplos de remodelação navio causadas pela contração matriz local, longa- duração (12 horas), imagiologia de interacções de células T com as células tumorais e a migração de células do tumor ao longo de colagénio IV da membrana basal. Tais eventos podem ser visualizados ao mesmo tempo, o registro de parâmetros fisiológicos locais, como pe dos vasos sanguíneosrmeability e drenagem linfática.

Protocolo

Todos os procedimentos realizados em animais estavam em estrita conformidade com a Swiss Animal Protection Act, a lei sobre a protecção dos animais e com a lei sobre a experimentação animal. Confirmamos que o nosso Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC), denominado Comissão de Vigilância de l'Etat de Vaud (Número da licença: 2687), aprovado especificamente neste estudo.

1. Inoculação do tumor da orelha

1. Culturas B16-F10-GFP em células de melanoma de um prato de 10 centímetros de Petri com DMEM + 10% de meio FBS.
2. Quando as células são 80-90% confluentes, lavá-las com PBS e destacá-las através de tripsinização. Girar as células a 1500 x g por 5 min a 4 ° C, ressuspender o sedimento em 1 ml de solução de Ringer e transferi-la para um tubo Eppendorf de 1,5 ml. Girar novamente e remover todo o sobrenadante com excepção de uma fina camada de suporte que fica logo acima do pellet. Volte a suspender as células para acabar com uma suspensão de células de espessura.
3. Anestesiar o rato com uma mistura de ketamina / dorbene [medetomidine] (75mg/kg-1mg/kg) e confirme se o animal é suficientemente anestesiados através da realização de uma pitada dedo gentil. Aumentar a concentração de isoflurano em passos de 0,1% nos movimentos de casos são observadas (por exemplo, a retirada da pata). Manter rato em uma almofada de aquecimento controlado termistor rectal (37 ° C) durante todo o processo e proteger os olhos com uma pomada oftálmica adequada.
4. Prepara-se uma seringa de Hamilton (33 agulha G, 10 ml de volume de seringa). Remover a tampa da ponta da agulha e com carga de 20 ul de suspensão de células no topo da câmara de bico. Puxe o êmbolo até 5 ml de chorume é carregado para dentro da seringa. Retire o excesso de lama da câmara de ponta e feche a tampa da ponta.
5. Usando fita adesiva, fixe a extremidade proximal da orelha sobre a ponta de um dedo indicador. Em um ângulo de 45 °, introduza lentamente a agulha da seringa Hamilton entre derme dorsal e da cartilagem. Uma vez dentro, penetrar no ouvido proximal para distal por cerca de 2-3 mm.
   Nota: O procedimento de injeção de células deve ser feito por um técnico treinado e certificado. Além disso, este processo tem de ser executadas lentamente e em sequência: primeiro a agulha deve ser colocado na horizontal para a pele da orelha e inserido lentamente na derme da orelha. Uma vez e apenas em seguida, a ponta da agulha está na pele, o êmbolo deverá ser pressionado. Pressionando o êmbolo vai iniciar células inoculação na pele. No caso improvável de a agulha de passagem das duas camadas da derme da orelha, a camada de cartilagem e entra na pele da pessoa que executa a experiência, a dor infligida ao dedo experimentador deve ser considerada como um sinal de alarme e de provocar a retracção imediato da agulha da pele experimentador. Nesse caso, o êmbolo não deve ser pressionado e pele deve ser esterilizado com álcool. Alternativamente, objecto inanimado em vez de um dedo pode ser usado para estabilizar a orelha.
6. Injectar 3 ul lama celular e retrair-se lentamente a agulha a partir da orelha.Deixe as células tumorais formam um tumor sólido, durante 7-9 dias e acompanhar o crescimento do tumor por meio de um microscópio estereoscópico de fluorescência.
7. Alternativamente, a seguir os passos iniciais da interacção das células tumorais com a matriz de tecido, aplicar 50 ul de 100.000 células tumorais em suspensão na solução de Ringer na derme exposta da orelha e manchados (após o passo 3.3).

2. Cirurgia Orelha

1. Três dias antes do experimento, raspar a cabeça de rato, depilar os pêlos ao redor da cabeça e orelha (10-15 seg) e enxaguar com água.
2. Anestesiar o rato com uma mistura de oxigênio umidificado e isoflurano (3-4% de indução, manutenção de 1-2%) e confirme se o animal é suficientemente anestesiados através da realização de uma pitada dedo gentil. Aumentar a concentração de isoflurano em passos de 0,1% nos movimentos de casos são observadas (por exemplo, a retirada da pata). Manter rato em uma almofada de aquecimento controlado termistor rectal (37 ° C) durante todo o processo e proteger os olhos com umpomada oftálmica adequada.
3. Construir uma plataforma feita de 8 coladas lâminas histológicas de vidro. Vire o rato em suas costas e coloque delicadamente a orelha-bearing tumor na pilha de lâminas de vidro. Use pequenas listras de fita adesiva para fixar as bordas anterior e posterior da orelha para a pilha.
4. Cortar a pele ventral da orelha ao longo da antihélice do pavilhão auricular do rato utilizando um bisturi. Com a ajuda de uma pinça curvos, descascar suavemente derme ventral e da cartilagem da derme dorsal onde o tumor foi inoculado. Retire a pele e cartilagem ventral com uma pinça curva, expondo a derme dorsal. NOTA: Se os grandes vasos da orelha são cortados, ou a circulação sanguínea não retorna ao fluxo normal dentro de 15 minutos, a orelha não pode ser usado para geração de imagens. Mantenha sempre a pele da orelha abriu molhada usando tampão de Ringer e proteger a umidade usando uma lamela.
5. No caso de haver sangramento persistente vasos tumorais forma, parar o sangramento, adicionando 100 mltrombina (5 U / ml) em tampão de Ringer (NaCl 102 mM, KCl 5 mM, CaCl2 ₂ mM, lactato de sódio 28 mM) na parte superior da orelha por 5 min.
6. Lava-se a orelha, duas vezes com aproximadamente 5 ml de tampão de Ringer e remover líquido adicional com toalhetes estéreis. Proceder de imediato para a próxima etapa (não deixe que o ouvido aberto seco em qualquer ponto!).

3. Imunofluorescência Coloração

Tampão de Use Ringer suplementado com soro humano (1:10), rato policlonal anticorpo secundário para IgG humano (1:50), e 125 UI / ml (2,5 mg / ml de aprotinina) (tampão de bloqueio), para todos os passos de coloração. Aprotinina inibe a plasmina promoção da coagulação, para limitar a hemorragia inicial que pode ocorrer após a cirurgia.

1. Dobre a parte do ouvido com a derme abertas na concha eminentia e secar os exteriores derme ouvido fechados com panos estéreis. Imobilizar o ouvido na pilha de lâmina de vidro através da aplicação de 0,5 mL de cola cirúrgica para o anterior e posterior dorsol bordas. Em seguida, alise suavemente a derme dorsal da orelha sobre o vidro.
2. Aplicar anticorpos primários moléculas alvo extracelulares da matriz, a uma concentração de 10 ug / ml em um volume total de 100 ul de tampão de bloqueio para o ouvido exposta. Cobrir a orelha com uma lamela de cobertura, a fim de impedir que a solução de coloração para secar sobre as bordas das orelhas. Incubar durante 15 min. Lava-se a orelha, duas vezes com aproximadamente 5 ml de tampão de Ringer.
3. Aplicar os anticorpos secundários apropriados ou conjugados estreptavidina (fluoróforos com um comprimento de onda de excitação de alta tal como 594 nm ou 647 nm, são favoráveis ​​para imagiologia intravital) a uma concentração de 10 ug / ml em um volume total de 100 ul de tampão de bloqueio para o ouvido exposta. Cobrir a orelha com uma lamela e incubar por 15 min. Lava-se a orelha, duas vezes com aproximadamente 5 ml de tampão de Ringer.

4. Interação de esplenócitos ativado transmitidas pelo sangue com células tumorais in situ

1. 7 dias após inoculation de GFP-B16-F10 de melanoma na pele de trás do rato congênica, sacrificar o animal e recolher baços. Isolar esplenócitos com ruptura mecânica do baço através de um filtro de células de 70 ^ m.
2. Esplenócitos do rótulo para 8 min a 37 ° C com Vermelho CMTPX mancha citoplasma da célula (1 uM em PBS), lavar 4 vezes em 15 ml, a 4 ° C e injectar imediatamente com meio isento de soro de 200 ul na veia da cauda de rato cujos ouvidos foram inoculados com B16-F10-GFP 7 dias antes.

5. Imagens intravital usando um Stereomicroscope

1. Para imagiologia de curto prazo (até 2 horas), adicionar tampão estéril, preparado no ascorbato-Ringer contendo 140 ascorbato de sódio mM, HEPES 10 mM, KCl 4 mM e 5 mM de _CaCl2, a pH 7,5 (final de tampão de ascorbato-Ringer osmolaridade 320 mOsM) na parte superior da orelha imobilizada. Cobrir a orelha com uma lamela e começar a imagem usando um microscópio estereoscópico fluorescência com lente 2X.
2. Para imagens de longo prazo(Mais de 2 horas), colocar a tomada de uma agulha (ligada a um reservatório contendo solução tampão de ácido ascórbico-Ringer) sob a lamela, cerca de 0,5 cm de distância da orelha. Usar uma bomba peristáltica a uma velocidade de 1 mL / min para proporcionar constantemente tampão de ascorbato-Ringer para a câmara sob a lamela.
3. Altere a lente 1X (distância de trabalho seis centímetros) para lente 2X (distância de trabalho 2cm). Abra o software de aquisição e configurar as definições do estereomicroscópio fluorescente. Em câmera configurações escolher 12 bits como a profundidade de cor da imagem e ajustar a gama de câmaras de valores em escala de cinza de 0% (mínimo) e 5,1% (máxima) e definir a correção de gama para 2.
   1. Definir ganho aquisição de 1 (mínimo), a intensidade de fluorescência para 1000 (máximo), ampliação definido para 280x-320X e ajustar o tempo de exposição evitando super ou sub-exposição (tempo de exposição deve ser de menos de 1 seg.) Dependendo do número de campos de imagem (geralmente 10 a 20), nos intervalos de tempo para o ciclo de aquisição deve ser definido sertre 1 a 2 min. Encurtar os tempos pode causar a descoloração e fototoxicidade.
4. Escolha vários campos que contêm células tumorais, bem como as proteínas da MEC corados (como na Figura 3). Usando a fase motorizada, adquirir imagens dos canais fluorescentes apropriados (tais como GFP e fluoróforo 647 na Figura 3) ao longo do tempo (por exemplo, a cada 2 minutos).
5. Após o experimento, a eutanásia o mouse de acordo com as diretrizes institucionais de animais. Neste caso, no final da experiência, o rato anestesiado a eutanásia por deslocamento cervical seguido por sangria (perfusão intracardíaca).

6. Imagens intravital usando um Microscópio Multiphoton

1. Usando massa de silicone, construir uma parede circular de cerca de 2 cm de diâmetro e 2-3 mm de altura ao redor da orelha, começando na base da orelha. Certifique-se que não há pontos de vazamento. Preencha o círculo com tampão de ascorbato-Ringer.
2. Colocar o mousesobre o palco e ligar a almofada de aquecimento (37 ° C).
3. Software de aquisição de Abrir e configurar as definições do microscópio multiphoton.
4. Escolhe-se a quatro campos diferentes que contêm as células do tumor e proteínas ECM coradas (tal como na Figura 3). Neste exemplo, ajustar o laser Ti-Saphire a 850 nm para GFP sinalizar um subseqüente fóton único 647 para 647 fluorophore coloração e visualize colágenos fibrilares com SHG. Adquirir imagens dos canais apropriados fluorescentes (como GFP e fluoróforo 647 na Figura 3) e segunda geração harmônica ao longo do tempo, por exemplo, a cada 2 min, com imersão em água HCX APO 20X com 1,00 lente NA e 2 mm de distância de trabalho.
5. Após o experimento, eutanásia rato anestesiado com deslocamento cervical seguido de sangria (intracardíaca perfusão).

Resultados

Até à data, a imunocoloração em tecido vivo não é normalmente usado devido à formação de complexos imunitários que conduzem à coloração de fundo elevado e imunotoxicidade ^20. Este foi superado pelo pré-bloqueio dos receptores Fcy em macrófagos teciduais, portanto, "cegar" dessas células para posterior immunostaining forte indireta. À medida que a marcação foi extracelular, fototoxicidade e fluoróforo branqueamento, podem ser controlados por imersão do tecido em antioxidante natural tamponada, ácido ascórbico isosmótica (Fig. 1A). Desde a nossa primeira descrição do método ^5, melhoramos o nosso anti-branqueamento e anti-phototoxic técnica para que a fotodegradação agora podem não só ser inibida, mas completamente impedido (Fig. 1B). Isto é feito através da incorporação da orelha num grande volume de antioxidante (100 ul) no interior da câmara, onde a orelha é imobilizado. Note-se que 300 segundo tempo imagem constante corresponde a 10 horas de imagem quando as imagens sãocoletado para 500 ms cada um minuto (as configurações de imagem média).

Figura 1. Fotodegradação e fototoxicidade foi parado através da substituição com cloreto de ascorbato em tampão de Ringer e a incorporação da orelha exposta num volume de 100 ul da solução. (A) Tecido foi corada com um primeiro anticorpo biotinilado contra colagénio IV, o componente da membrana basal. A coloração foi depois detectado com estreptavidina-647 (vermelho), e, em seguida, continuamente trabalhada durante 300 segundos em qualquer tampão de Ringer normal (painel superior) ou ascorbato-Ringer (painel inferior) de. Note-se que 300 segundo tempo de imagem constante corresponde a 10 horas de imagem quando as imagens são recolhidas por 500 ms cada um minuto (as configurações de imagem habituais). O mais brilhante de 25% do pivalores de intensidade xel são de cor verde. (B) Quantificação do decaimento de imunofluorescência (50% em vs de Ringer 0% em ascorbato-Ringer). Os valores foram normalizados para a fluorescência inicial. Imagens recolhidas com imunofluorescência estereoscópico. Barra de escala em A, 100 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Investigando a interação entre células metastáticas do tumor e estroma tumoral é crucial para entender o processo de migração de células tumorais ea imunidade tumor. Isto é porque o estroma associado a um tumor compõe-se de 90% da massa do tumor e regula activamente o crescimento de tumores e metástase ^21. No entanto, a visão mecanicista de como a migração de células tumorais para unidades matriciais ou linfática ou vasos sanguíneos que falta ^22. Isto é parcialmente devido ao fato de que intravital imenvelhecimento das proteínas da matriz é limitada para a visualização de fibras de colagénio fibrilar amadurecidos utilizando segunda geração de harmónicas em microscopia de dois fotões ^23. Por isso, nós adaptamos o nosso método para a visualização do microambiente tecido incluindo os vasos sanguíneos e linfáticos, pericitos, nervos, músculos e adipócitos para incluem a visualização directa dos componentes da matriz extracelular. Muitas estruturas podem ser distinguidos com base na sua morfologia, após imunocoloração para componentes de membrana basal, tais como colagénio IV ou perlecan (Fig. 2A), no entanto, a coloração directa de marcadores específicos da superfície celular, por exemplo, Lyve1 (Fig. 2B e C) e podoplanin (Fig. . 2C), permite ainda distinguir, vasos linfáticos capilares iniciais (Lyve1 ⁺⁾ a partir de coletores linfáticos (Lyve1 ^-). A coloração para CCL21 ligado à matriz na pele revelou depósitos desta quimiocina na membrana basal dos coletores linfáticos identified com a coloração para perlecano, o proteoglicano de sulfato de heparano (Fig. 2D).

Figura 2. Exemplos de coloração ao vivo em um normal orelhas de rato. (A) A coloração para perlecan, um componente da membrana basal, retrata todos os vasos sanguíneos e linfáticos, nervos, fibras musculares e adipócitos. (B) coloração Lyve1 marca a rede capilar linfático inicial. (C) Co-coloração para Lyve1 e podoplanin, um marcador pan-linfática, representa as redes de vasos linfáticos iniciais e coleta. A derme dorsal da orelha podem ser visualizados através de microscopia de epifluorescência clássico (sem seccionamento óptico) como a derme de ouvido tem baixo número de adipócitos que de outra forma cobrir o campo de imagem. (D) stai CCL21 ning (verde) na membrana basal linfático corado para perlecan (vermelho). Imagens recolhidas com imunofluorescência estereoscópico. As barras de escala em A e B, 1 mm; em C, 100 mm e 50 mm em D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Mais importante ainda, as proteínas estruturais que, normalmente, não podem ser detectados por SHG, o método de detecção da matriz clássico ^23, pode ser visualizada. Por exemplo, verificou-se que a tenascina C (figura 3A), uma proteína de matriz que é expressa durante a tumorigénese, a cicatrização de feridas e inflamação ¹⁹ é depositada em diferentes locais do estroma do tumor do que colagénios fibrilares (Fig. 3B). Esta heterogeneidade matriz pode afetar a distribuição de células de tumores e metástases (Fig. 3C).

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Figura 3. A derme dorsal da orelha pode ser ao vivo fotografada usando microscopia multi-fotão. Um único domínio de tumor B16-F10. Tumor do estroma foi marcado com anticorpo tenascina C ea coloração foi detectado com anti-cabra-594 anticorpo burro. Imunofluorescência da tenascina C (vermelho) de rede é mostrada em A e colágenos fibrilares detectado com geração de segundo harmônico (SGH) em B. Estas duas redes são sobrepostas com as células tumorais (ciano) em C (mesclados). Matriz tumor New marcado por tenascina C não se sobrepõe colágenos fibrilares detectados com SHG (verde). A imagem com 44, quatro vezes a média de z-seções com z-passo 1,0 mM foi adquirida em modo de profundidade de cor de 16 bits. Imagens recolhidas com dois fótons microscópio. Barra de escala, com 100 m.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após a imunomarcação de diferentes componentes da matriz tumor (por exemplo, tenascina C e colágeno IV) da matriz tumor poderíamos identificado restrito e eventos repentinos de tumor remodelação direcional matriz (Video 1). As forças que se desenvolvem no interior microambiente do tumor pode levar a uma expansão ou contracção da matriz tumoral e na remodelação consequência e alongamento da vasculatura do tumor para um nível semelhante, como mostrámos anteriormente, no caso da cicatrização de feridas ^11,24.

Video 1. Expansão da matriz tumor rotulado com colágeno IV (vermelho) e tenascina C (ciano) alongar os vasos sanguíneos (seta) e passivamente translocam três células tumorais (verde). Contração localizada de teascin rico em C tumor matriz translocate vasos sanguíneos (orientado horizontalmente vermelho structure) por cerca de 100 mm durante 12 horas de imagiologia. Imagens recolhidas com imunofluorescência estereoscópico. Clique aqui para ver o vídeo.

Usando a microscopia multi-fotão com rotulagem fluoróforo é problemático como fluxo de fótons usado nesses experimentos vai branquear rapidamente corantes fluorescentes que não estão protegidas contra a oxidação ^25. Aqui nós mostramos que podemos realizar microscopia de lapso de tempo de dois fótons, ao mesmo tempo imaginando immunolabeled matriz tenascina C, com mínima de fotodegradação fluorophores mesmo em microscopia de dois fótons de alta densidade de fótons (vídeo 2).

Video 2. Baixo nível de fotodegradação da tenascina C imunofluorescência (vermelho) durante a microscopia de dois fótons. Células tumorais B16-F10-GFP (ciano) foram fotografadas no ouvido aberto dorsal 9 dias após a inoculação. O sinal fluorescente foi protegido pelo pedido de ascorbato-Tampão de Ringer para o tecido trabalhada. Geração de segundo harmônico (verde) não se sobrepõe com a nova matriz representada por C. imagem de profundidade de cor de 16 bits tenascina com 11, quatro vezes a média de z-seções com z-passo 1,9 mM foi adquirida por 15 min. As imagens foram coletadas a cada 1 minuto 5 segundos no 6 z-aviões coletados. Clique aqui para ver o vídeo.

Também fotografada interações célula-imune com as células tumorais metastáticas. Esplenócitos CMTPX rotuladas de um rato portador de tumor extravasado dos vasos sanguíneos associados ao tumor 8 horas após iv transfusão, invadiu a matriz tumoral e ativamente interagiu com células tumorais através da formação de longa duração contactos celulares (vídeo 2). Estruturas Fluoróforo-647-rotulados de colágeno IV foram resistentes à fotodegradação durante as 12 horas de imagens.

Vídeo 3. Interação de esplenócitos CMTPX rotuladas de tumor (B16-F10)-bearing rato com células tumorais individuais (GFP-B16-F10). esplenócitos foram iv transfundido após a coloração de tecidos para colágeno IV. Colágeno IV-verde (647), esplenócitos-vermelho (CMTPX), ciano B16-F10 (GFP). Imagens recolhidas com imunofluorescência estereoscópico. Duração do vídeo de 12 horas. Clique aqui para ver o vídeo.

Células tumorais recentemente isoladas foram sobrepostos na derme da orelha expostos pré-coradas para colágeno IV. Poderíamos observado que depois de aderir ao tecido a alguns grupos de células começaram a migração colectivo ao longo da membrana basal dos vasos sanguíneos e adipócitos.

As células tumorais Video 4. Migram ao longo membranas basais. Pele da orelha normal corada para colágeno IV (647, vermelho) foi sobreposto com células B16-F10-GFP recém subculturas e fotografada por 5 horas. Algumas células tumorais que aderiram ao tecido começou migração colectiva juntamentemembrana basal dos vasos sanguíneos e adipócitos. Imagens recolhidas com imunofluorescência estereoscópico. Duração de vídeo:. 5 horas Clique aqui para ver o vídeo.

Além disso, como a derme de ouvido é praticamente bidimensional, poderíamos facilmente coletar grandes volumes de dados usando fluorescência rápido lupa estereoscópica, em vez de confocal mais lento e mais caro ou microscopia multiphoton. No entanto, também é possível utilizar qualquer um dos métodos de microscopia de varrimento mencionados com a intravital SE preparações (Fig. 3, 1) de vídeo.

Discussão

Significado

Aqui é apresentado um método de microscopia intravital novela que permite alta resolução e visualização dinâmica de diferentes componentes do microambiente do tecido, incluindo fibrilar, bem como as proteínas da matriz do tipo de rede. Este método possui várias vantagens sobre as técnicas de imagiologia actuais intravital: (i) de imagens de fluorescência intravital tem sido utilizado em estudos de microcirculação, por exemplo, para controlar fugas de soluto a partir do sangue ou no sistema linfático, mas não tem sido combinada com a imunocoloração. (Ii) A utilização de ratinhos repórter geneticamente modificados permite a tipos específicos de células a ser trabalhada, mas requer a disponibilidade (ou esforço substancial para criar novos) e limita o número de interagir tipos de células que podem ser estudadas. (Iii) a matriz extracelular pode ser trabalhada in vivo utilizando segunda geração de harmónicas, mas esta técnica apenas pode detectar colagénios fibrosos, deixando um grande número de componentes extracelulares importantescomo membranas basais, fibronectinas, tenascins, fatores de crescimento, quimiocinas e glicosaminoglicanos do tecido fora do alcance para a pesquisa atual. Nosso método supere essas limitações, e permite que as técnicas de imagem padrão a ser incorporado e ainda combinado com imunomarcações para outros tipos de células, estruturas de tecido, os depósitos de sulfato de heparina fatores de crescimento (por exemplo VEGF ²⁶⁾ e quimiocinas CCL21 ^(5,18 e fig. 2D vinculativos ,) ou de proteínas de matriz extracelular ao mesmo tempo, de rastreamento de sangue e / ou o fluxo linfático.

Limitações

A imagem de epifluorescência intravital IF se limita aos retalhos de pele fina, privadas da hipoderme de espessura (tecido adiposo). Enquanto nós descobrimos que a derme dorsal da orelha é óptima para a exposição cirúrgica relativamente inofensivos da pele da orelha, com epifluorescência intravital técnica IF não está limitado a derme da orelha e poderia potencialmente ser aplicado a, por exemploa pele exposta dos dedos dos pés ou pele dorsal do rato recém-nascido. Coloração de anticorpos rápida (15 minutos) em imunofluorescência IF não é dependente de difusão passiva, mas requer drenagem linfática funcional e fluxo de fluido intersticial, portanto, nenhuma coloração pode ser observado se os vasos linfáticos são ocluído ^27. Em consonância com isso, os vasos linfáticos manchar mais forte vasculatura sangue depois gotejante (vasos feridos, arteríolas) ^5. A separação do dorsal e ventral retalhos de pele de ouvido é um procedimento cirúrgico leve mas causa prejuízo a alguns capilares e morte celular para várias células do tecido. Isso pode ser um problema quando é preciso investigar o tecido completamente intacto, por exemplo, olhando para o efeito suave de drogas na sobrevivência celular. Além disso, a aplicação de anti-oxidante que serve para proteger a pele contra a fototoxicidade e fotobranqueamento exclui o uso da técnica de imunofluorescência intravital estudar por exemplo, o estresse oxidativo tecidual ou biolog óxido nítricoy.

Finalmente, ofuscante de macrófagos residentes tecido com complexos imunes podem ativar essas células e influência por exemplo, o estudo do tecido resposta imunológica e ativação de células dendríticas.

Modificações e solução de problemas

A fim de estudar o stress oxidativo tecidual ou biologia de óxido nítrico, o ácido ascórbico tem de ser substituído por outros meios compatíveis com tecidos que não interferem com a produção experimental. Da mesma forma, bloqueando os receptores Fc nas células imunes dérmicas devem ser evitados, se o objetivo do estudo é a função e ativação da resposta imune do tecido e ativação de células dendríticas e migração. Isto pode ser feito com o uso do anticorpo secundário com Fc fragmento clivado (F (ab) 2 de anticorpos) ou o uso de anticorpo biotinilado e estreptavidina fluorescente como reagentes de detecção.

As aplicações futuras

Nós apresentamos um intra novo e únicovital SE técnica para imagem componentes não fibrilares da matriz extracelular em tumores de pele para transplante em combinação com fibrilar SHG-detectados e colágenos amadurecido através da microscopia de dois fótons. Uma das vantagens da utilização de microscopia multi-fotão (ou confocal) ao longo de imagiologia epifluorescência é possibilidade z empilhamento e em consequência espacial de co-localização de eventos que ocorrem no interior da matriz extracelular, por exemplo, intravasamento tumor linfático ou em vasos sanguíneos, o que no caso de microscopia de epifluorescência padrão pode apenas ser inferida a partir de alterações morfológicas na célula invasora. Esta técnica tem um potencial muito mais amplo. Por exemplo, usamos o intravital IF para investigar o mecanismo de oclusão linfático por terapia fotodinâmica específicas de linfático ^27. Aplicações potenciais adicionais deste método incluem, mas não estão limitados a investigação de imunidade da pele durante a inflamação, o mecanismo de rejeição ou métodos de sangue e linfa transplante o crescimento dos vasos ATIC durante tumorigênese.

Etapas críticas do processo

O passo mais importante que tem implicações importantes para manter um ambiente de tecido fisiológico é uma separação cirúrgica da pele ventral e dorsal da cartilagem da derme. Cortar ou obstruindo a principal artéria ou veia vai levar a sangramento excessivo e hipóxia tecidual local, o que afetará a resposta celular aos tratamentos e movimento celular ^8. Imobilização da orelha com cola cirúrgica deve ser feito com cuidado, como o derrame da cola em expor o tecido vai causar uma lesão permanente no tecido, por oclusão de vasos sanguíneos. A temperatura do rato deve ser controlada e mantida a 37 ° C. Além disso, o oxigénio humidificado necessita de ser usado para a anestesia de isoflurano, de modo que os olhos e os pulmões ficar adequadamente humidificado durante a experiência. Além disso, ascorbato de sódio deve ser preparada imediatamente e seu pH verificados antes do uso.

ntent "> Em resumo, este imunofluorescência intravital pontes em tempo real, medições locais da função fisiológica com imagem molecular de eventos celulares complexas na pele do rato. Além disso, este método tem um grande potencial, pois ele pode ser facilmente aplicada a ex estudo de pós-desenvolvimento mecanismos de sangue e linfa-angiogénese ou para visualizar as fases iniciais da infecção cutânea por vários agentes patogénicos. Com a sua flexibilidade e potencial de alto rendimento, esta técnica intravital pode contribuir significativamente para várias áreas da biologia.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos Linhagem
BALB/C camundongos (8-12 semanas)	Charles River		Orleans, França
Camundongos C57/Bl6 (8-12 semanas)	Harlan		Carshalton UK
Cell Line
B16 F10 Melanoma expressando OVA-GFP
Manutenção de anestesia
Isofluorano	Minrad Inc.	2222	Minrad Inc., Buffalo, NY
Sistema de entrega umidificado	Rothhacher GmBH		Berne, Suíça
Sistema de Controle de Temperatura DC	FHC Inc		Bowdoin, MA
Estereomicroscópio
Estereomicroscópio de fluorescência com platina motorizada .	M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Alemanha
Lente 1X (ampliação do sistema linear de 7,5X a 160X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Alemanha
Lente 2X (ampliação do sistema linear de 15,6X a 320X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Alemanha
Câmera DFC 350 FX controlada pelo software LAS AF	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Alemanha
Microscopia Multifotônica
LEICA SP5, multiplicador de dois fótons, platina motorizada	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Alemanha
HCX APO 20X/1.2 imersão em óleo
Laser Ultra Chameleon
Tampão de Ringer (102 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 28 mM de lactato de sódio)	B. Braun Medical AG	445968	Sempach, Alemanha
Aprotinina	Elastina	AP92	Owensville, MO
Trombina	Sigma-Aldrich	T7326-1KU	Taufkirchen, Alemanha
Ascorbato de sódio	Sigma-Aldrich	11140-50G	Taufkirchen, Alemanha
Soro de camundongo criado contra IgG humano	Abcam	ab34834	Cambridge, UK
Colágeno IV	Abcam	AB6581	Cambridge, Reino Unido
Perlacan	RnD	ab79465	Minneapolis, MN
Tenascin C	RnD	AF3358	Minneapolis, MN
Podoplanin	RnD	AF3244	Minneapolis, MN
LYVE-1	Reliatech	103-PA50	Wolfenbü ttel, Alemanha
CCL21	RnD	AF457	Minneapolis, MN
Streptavidin Pacific Blue	Invitrogen	S11222	Grand Island, NY
Streptavidin Alexa 647	Invitrogen	S21374	Grand Island, NY
Streptavidin Alexa 488	Invitrogen	S11223	Grand Island, NY
Burro Anti Cabra 594	Invitrogen	A21113	Grand Island, NY
Burro Anti Coelho 594	Invitrogen	A21207	Grand Island, NY
CMTPX CellTracker	Lifetechnologies	C34552	Carlsbad, Califórnia
Histocryl (cola cirúrgica)	Braun Aesculap	1050060	Tuttlingen, Alemanha
Reagentes de Cultura de Células
Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM	Gibco Invitrogen	E15-843	Grand Island, NY
Soro fetal bovino (FBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY
Tripsina	Gibco Invitrogen	25300062	Grand Island, NY
PBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY